Диссертация (1174192), страница 2
Текст из файла (страница 2)
ПЭГилированные липосомы, ковалентно связанные с моноклональными антителами к поверхностным антигенам опухолевых клеток, обеспечивают селективную доставку лекарственных препаратов непосредственно в8очаг опухоли [4] Включение в состав липосом липидов с положительно заряженными группами позволяет получить катионизированные липосомы, способные, вопервых, электростатически связывать ДНК, а, во-вторых, повысить эффективностьих взаимодействия с отрицательно заряженной клеточной мембраной и таким образом служить средством внутриклеточной доставки терапевтических генов [4, 5].В случае разработки наноконтейнерных препаратов на основе интеркалирующих противоопухолевых средств или терапевтических генов конечной молекулярной точкой их приложения является ядерная ДНК соответствующих клеток-мишеней.
Поэтому интернализация наноконтейнера, высвобождение активного вещества в цитоплазму и/или внутриклеточные органеллы и проникновение в ядроклетки становятся ключевыми механизмами, определяющими эффективность адресной доставки нанобиотехнологического препарата [5].Конкретный механизм эндоцитоза предопределяет дальнейшую судьбу поглощенного наноконтейнера: окажется ли его содержимое в поздних эндосомах илибудет высвобождено в цитоплазму. Поэтому исследование механизмов интернализации адресных наноконтейнеров представляется крайне актуальной проблемой,решение которой может существенно обогатить разнообразие подходов к эффективной внутриклеточной доставке. На процесс прохождения препарата через клеточную мембрану и дальнейшее высвобождение влияет множество факторов, вчисле которых: химическая природа наноконтейнера, его размер, заряд, форма,свойства конъюгированной с наноконтейнером векторной молекулы [6] [7] [8].Выбор мишени, которая будет одновременно специфична для опухолевых клеток и доступна для связывания векторной молекулой, является одной из основныхзадач для специфичной направленной доставки наноконтейнерного препарата.В нашем исследовании в качестве векторных молекул для адресной доставкибыли выбраны моноклональные антитела к поверхностным белкам-маркерам, повышенная экспрессия которых наблюдается в опухолевых клетках: рецептору фактора роста эндотелия сосудов VEGF 2 типа (VEGFR2, KDR), а также моноклональные антитела к VEGF.
Повышенная экспрессия опухолевыми клетками гена VEGFи его рецепторов показана для многих злокачественных новообразований, в том9числе и для мультиформной глиобластомы [9].Особенностью эндотелиоцитов микроциркуляторного русла низкодифференцированных глиальных опухолей является феномен повышения сосудистой проницаемости, обусловленный, в частности, гиперэкспрессией гена VEGF и его рецепторов, что может быть одной из причин патологического неоангиогенеза. Патологический рост сосудов на фоне снижения экспрессии генов белков плотных контактов в конечном итоге нарушает целостность ГЭБ в опухоли, что делает возможным проникновение и накопление в опухолевой ткани наноконтейнерных препаратов диаметром до 150 — 200 нм [10] [11] [12].Хирургическое лечение больных с мультиформной глиобластомой не приноситожидаемого эффекта, так как не позволяет тотально удалить опухоль из-за ее активной инвазии в окружающую ткань мозга.
Поэтому одним из наиболее актуальных подходов к терапии глиобластом является усовершенствование не столько хирургического лечения, сколько химиотерапевтических методов и современных технологий генной терапии.Конъюгация наноконтейнера с моноклональными антителами к поверхностному маркеру теоретически должна обеспечивать прочную фиксацию наноконтейнера на поверхности клетки-мишени в результате антиген-антительного взаимодействия, что в дальнейшем может облегчать интернализацию фиксированного намембране наноконтейнера. Однако, механизмы такой интернализации исследованынедостаточно.Цель и задачи исследованияЦель: исследовать механизмы интернализации наноконтейнерных систем, векторизованных с помощью моноклональных антител к VEGFR2 и VEGF в клеткинизкодифференцированной глиомы.10Задачи исследования:1. Получить и охарактеризовать катионизированные иммуно-липосомальныесистемы, векторизованные моноклональными анти- VEGF и VEGFR2 антителами.2.
Получить и охарактеризовать наногелевые контейнерные системы, векторизованные моноклональными анти- VEGF и VEGFR2 антителами.3. Исследовать селективность наноконтейнерных систем на основе катионизированных иммунолипосом и наногелей, векторизованных анти- VEGF и VEGFR2антителами, по отношению к клеткам низкодифференцированных глиом.4.
Охарактеризовать молекулярные механизмы интернализации векторных катионизированных липосом и наногелей на модельной культуре клеток низкодифференцированных глиом.5. Изучить эффективность доставки флюоресцентно-меченных плазмидныхДНК с помощью полученных векторных наноконтейнеров.Научная новизнаВпервые показано, что векторизованные с помощью моноклональных антителк VEGF и VEGFR2 наноконтейнеры достоверно более эффективно интернализуются в клетки низкодифференцированной глиомы (глиома С6 крысы).Впервые показано, что векторные липосомы интернализуются в клетки глиомыС6 путем клатрин-зависимого, но не кавеолин-опосредованного эндоцитоза в отличие от наногелей, коньюгированных с моноклональными анти - VEGF и VEGFR2антителами.Практическая значимостьПолученные в работе результаты могут служить основой для разработки технологии производства векторных наноконтейнерных средств доставки химиотерапевтических агентов и генотерапевтических средств, в частности противоопухолевых микроРНК.11Разработанные в процессе выполнения диссертационной работы подходы поколичественному анализу процессов интернализации с помощью сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с колокализационным анализом могут в дальнейшем применяться в качестве критерия оценки эффективности адресной доставки разрабатываемых адресных наноконтейнерных препаратов.Апробация диссертационной работыОсновные положения диссертационной работы были представлены на:Международной Пироговской научной медицинской конференции студентов имолодых ученых, Москва.
VIII Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва 2015), на 2 национальном конгрессе «Регенеративная медицина» (Москва, 2015), на VIII Международном Конгрессе “Neurotalk 2017”.Апробация диссертации была проведена на совместном заседании кафедры медицинских нанобиотехнологий и отдела медицинских нанобиотехнологий медикобиологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова МинздраваРоссии.ПубликацииПо материалам диссертационной работы опубликовано 5 статей в журналах,рекомендованных ВАК, а также 5 тезисов в материалах международных и российских конференций.Объём работыДиссертация состоит из введения, пяти глав, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя. Работа изложена на 112 машинописныхстраницах и содержит 21 рисунок и 4 таблицы.
Список литературы включает 33отечественных и 157 иностранных источников.12Личный вклад автораАвтор самостоятельно синтезировал наноконтейнерные системы, проводилизучение их свойств, выполнял все исследования, связанные с получением, обработкой и колокализационным анализом флюоресцентных изображений с помощьюсканирующей лазерной конфокальной микроскопии, осуществлял иммуноцитохимический анализ клеточных культур и статистическую обработку полученных данных.13ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫВиды эндоцитоза и механизмы интернализации таргетных лекарственных средств в клетки мишени1.1.ВведениеМультиформная глиобластома (GBM) — наиболее часто встречающаяся инаиболее злокачественная (IV степень) первичная опухоль мозга [13]. В отличие отопухолей мозга I — III степени злокачественности, GBM характеризуется присутствием атипических ядер, крайне высокой митотической активностью, а такженаличием участков некроза и микроваскулярной гиперплазии [14] Несмотря на интенсивные усилия исследователей и широкий перечень средств хирургического лечения, химио- и радиотерапии, только 2,5% больных GBM переживают пятилетний рубеж с момента постановки диагноза.
Неблагоприятный прогноз являетсяследствием агрессивной инвазии опухолевых клеток в периглиомную паренхиму.Инвазия - это комплекс процессов, опосредованных, с одной стороны, внутриклеточными механизмами, а с другой – внешними сигналами микроокружения и биофизическими сигналами из стромального матрикса [15]. Поэтому наиболее актуальным вопросом в терапии этого вида опухолей мозга является усовершенствование не столько хирургических методов лечения, сколько химиотерапевтическихподходов и современных способов генной терапии.
[16] ,[17] ,[18]Одним из перспективных направлений среди таких современных походов является направленный транспорт лекарственных и биологических активных препаратов в клетки – мишени опухолей. [19], [20], [21]В данном обзоре будут рассмотрены новые подходы к изучению наноконтейнерных систем, векторизованных с помощью моноклональных антител к белкаммишеням, для доставки генетических конструкций, лекарственных и биологическиактивных препаратов в клетки мультиформной глиобластомы, а также современные представления о механизмах их интернализации через клеточные мембраны.141.2.Генная терапияГенная терапия одна из современных стратегий лечения онкологических заболеваний, ключевым моментом которой является доставка «киллерной» генетической конструкции в клетку-мишень и её экспрессия, опосредующая гибель клеткивследствие либо выделения синглетного кислорода, либо другого токсического механизма [22].
Основным условием адресной доставки генетической конструкции вклетку-мишень является эффективная интернализация ее через мембрану. Среднийразмер генотерапевтической конструкции, содержащей киллерный ген составляет5000 пар оснований [23] Очевидно, что доставка такой крупной молекулы, какДНК, которая при этом ещё и отрицательно заряжена, требует особых приёмов, таких как упаковка в полиплексы, липосомы, полимерные или вирусные наночастицы.Все используемые на данный момент геннотерапевтические агенты можноразделить на вирусные и невирусные. Наиболее распространенным методом доставки терапевтических ДНК в клетки являются вирусные векторы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
