Диссертация (1155054), страница 24
Текст из файла (страница 24)
ТИА препаратыVCR и VLB растворяются в хлороформе (1 часть к 30 частям хлороформа), АТФпрактический не растворяется. Поэтому разработана методика для изолированияТИА препаратов от АТФ на основе их растворимости в хлороформе (рис. 5.7).ТИА препараты из полученного фильтрата после гель-фильтрации экстрагировали с помощью хлороформа в соотношении 1:2 в щелочной среде при 200С. Затем ТИА, растворенные в хлороформе, экстрагировались с помощью очи-щенной воды (1:1) в кислой среде. Полученный водный экстракт нейтрализовалии спектрофотометрическим методом определяли содержания ТИА препаратов вводном экстракте.
Полученные результаты представлены в таблице 5.12 (Приложение А, рис. 9).146Рис. 5.7. Этапы изолирования ТИА препаратов от АТФТаблица 5.12. Эффективность загрузки ТИА препаратов в клеточные носители всреде, модифицированной АТФ (2 мг/мл)№ колонкиВзято для инкубирования(мкг)Инкапсулированное количество(мкг)Эффективность загрузки, E (%)I2200VCR1001,874345,54II22001053,640247,89III22001114,939550,68IV22001083,115449,23V22001203,334054,70I2200VLB936,681642,58II22001224,960955,68III22001072,983748,77IV22001115,030350,68V22001065,452948,43Метрологическиехарактеристики= 49,61SD = 3,4161RSD = 0,06889Х ± ∆х = 49,61±4,249%(P- 95%)ξ = 8,5651 %= 49,23SD = 4,7126RSD = 0,957Х ± ∆х = 49,23±5,858%(P- 95%)ξ= 11,898 %Как видно из таблицы 5.12, средняя эффективность включения VCR в свежеизолированные эритроциты в модифицированной среде с 2 мг/мл АТФ составила 49,61 ± 4,249 % и VLB - 49,23 ± 5,858 % соответственно.
Относительная погрешность среднего результата ЭЗ ТИА в ЭН не превышала (ξ) 11,898%. Полученные результаты демонстрируют увеличение ЭЗ ТИА препаратов в модифи147цированной среде с АТФ на 5-7% по сравнению с немодифицированной средой.По литературными данными такое явления может быть за счёт увеличения проницаемости мембраны эритроцитов с участием АТФ.Сравнительные данные об эффективности включения ТИА препаратов вSD - стандартное отклонение, E% - эффективности загрузки ТИА; SE - стандартная ошибка среднегорезультатаРис. 5.8. Сравнительный график эффективности включения ТИА препаратов в ЭН вмодифицированной среде и в немодифицированной средеЭН в модифицированных средах приведены на рис. 5.8.148ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 5:1.
Установлено, что ТИА препараты обладают высокой способностью связываться с компонентами плазмы и форменными элементами крови. С компонентами плазмы связывание VCR составляет 52,67% ± 0,54 и VLB - 53,04% ± 0,27 отобщего связывающегося количества ТИА препаратов (ξ ≤ 0,1025 %; Р= 95%).
Сформенными элементами крови (эритроцитами) связывание VCR происходит на46,91 % ± 0,1073 %, а VLB на 46,23% ± 0,1017% (ξ ≤ 0,2288 %; Р= 95%) от вводимой дозы.2. Изучена эффективность загрузки ТИА препаратов в ЭН методом гипотонического лизиса с предварительным набуханием. Полученные данные свидетельствуют о довольно близкой степени включения исследуемых веществ в ЭН.Причем эффективность включения при использовании эритроцитов после 1- 4недель хранения значительно уменьшается и составляет 32,45 ± 3,4566 % дляVCR и 31,22 ± 5,5692 % для VLB (ξ≤ 17,841 %).
Эффективность включения ТИАв свежеизолированные эритроциты на 10-15% больше и составляет 42,96 ±3,946% и 44,27 ± 3,866% для VCR и VLB соответственно (ξ≤ 9,184 %).3. Исследовано влияние модифицированных сред на эффективность загрузкиТИА препаратов в эксперименте. При использовании среды, модифицированнойПЭГ-4000 и ПЭГ-400 при соотношении ТИА: ПЭГ- 1:20 наблюдается увеличение включения на 10 - 20 % в разных случаях (ξ ≤ 28,731 %; Р= 95%) и составляет для VCR - 65,70 % и для VLB - 55,86%.4. Полученные результаты показывают высокую эффективность загрузки ТИАпрепаратов в среде, модифицированной ДМСО c концентрацией 2,0 мг\мл.
Увеличения эффективности загрузки при этом повышается на 15 – 20 % и составляетдля VCR и VLB - 61,07 ± 3,21 % и 62,43 ± 3,15 % (P = 95%) соответственно (ξ ≤5,26 %).5. Эффективность включения ТИА препаратов в среде, модифицированной АТФс концентрацией 2 мг/мл, составила для VCR и VLB - 49,61 ± 4,249 % и 49,23 ±5,858 % соответственно (ξ ≤ 11,898 %). Полученные результаты демонстрируют149увеличение эффективности загрузки ТИА препаратов на 5-7% за счёт увеличения проницаемости мембраны эритроцитов с участием АТФ.6.
В соответствии с полученными экспериментальными данными определеныоптимальные условия для инкапсулирования ТИА препаратов в эритроцитах.Установлено, что модифицированная среда является оптимальной для загрузкиТИА препаратов.150ГЛАВА 6. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭН С ИНКАПСУЛИРОВАННЫМИ ТИА6.1.
Изучение свойств ТИА инкапсулированных эритроцитарных носителейin vitroУ полученной эритроцитарной лекарственной формы исследовали морфологические и функциональные свойства in vitro. Контролем служили отмытыеэритроциты, инкубируемые в фосфатном буфере без инкапсулирования ТИА сПЭГ и ДМСО.6.1.1. Изучение морфологии инкапсулированных ЭНДля оценки поверхностной архитектоники клеток использовали метод оптической микроскопии и сканирующей электронной микроскопии. Загруженныеэритроциты наблюдались под масляной иммерсионной линзой с помощью оптического микроскопа.На рисунках 6.1 и 6.2 видно, что эллипсоидальная форма после загрузки ненарушалась.
С помощью программы Toupviwe вычисляли диаметр эритроцитов(n=100), загруженных ТИА препаратами и контрольных эритроцитов в изотоническом буфере. Оптическое изображение исследуемых обьектов представлено нарис. 6.3 и 6.4.100Х (оптическое увеличение)2Х цифровое увеличениеРис. 6.1. Оптическое изображение эритроцитов с загруженными ТИА препаратами151Рис. 6.2.
Оптическое изображение контрольных эритроцитов и загруженныхТИА эритроцитов (4Х цифровое увеличение)слева – контрольные эритроциты, справа - ТИА препараты, загруженные в эритроцитыРис. 6.3. а. Контрольный эритроцит б. Эритроцит с загруженными ТИАОптическое микроскопическое изображение (6Х цифровое увеличение)Рис. 6.4. а. 2D Графическое представление распределения эритроцитов по диаметру, загруженных ТИА препаратами и контрольных эритроцитов (n=100);б. Метрологические характеристики изменения диаметра эритроцитов, загруженных ТИА препаратами и контрольных1526.1.1.1.
Изучения агрегационной способности ТИА инкапсулированныхэритроцитовХорошо известно, что увеличение агрегации эритроцитов ухудшает кровоток в микрососудах и доставку кислороды в ткани, способствует развитию тромбоза и ишемии. Описан прямой оптический метод определения агрегации эритроцитов, рекомендованный для использования комитетом экспертов ВОЗ постандартизации в гематологии.
Спонтанную агрегацию эритроцитов в аутологичной плазме исследовали методом оптической микроскопии в камере Горяева,определение доли свободных (не агрегированных) клеток в суспензии и количество клеток в агрегатах. При исследовании агрегатообразования ТИА инкапсулированных и контрольных эритроцитов, проводили их инкубацию в течении 15мин.
при 37 0С в аутологичной плазме при комнатной температуре. Установкадля агрегометрии эритроцитов включала: оптический микроскоп с длиннофокусным объективом 10х и фотоокуляром 10х; видеокамеру и компьютер. При регистрации оценивали число агрегированных и неагрегированных эритроцитов.Вычисляли отношение числа агрегатов к количеству неагрегированных клеток иэто отношение принимали как показатель агрегации эритроцитов (ПА). Неагрегированные эритроциты (ПНЭ) рассчитывали по формуле:ПНЭ = КСЭ×100/(СЭА+КСЭ),(6.1)где КСЭ - количество свободных эритроцитов, СЭА - сумма всех эритроцитов вагрегатах.Полученные результаты представлена в таблице 6.1., на рис.
6.5. и в Приложении А (рис. 10).Таблица 6.1. Изменение показателя агрегации ТИА инкапсулированных эритроцитовВремя(15 + t *)мин5101520Количества агрегированныхклеток (n)ТИА-EryКонтрольные(n)**эритроциты (n)**858990949898101100Агрегация эритроцитов (%) ± SDТИА-EryК.Э27,73 ± 1,129,6 ± 0,5530,53 ± 0,4931,46 ± 0,7427,6 ± 0,8230,52 ± 1,1531,82 ± 0,1832,47 ± 0,811532510510332,71 ± 0,843010910933,96 ± 0,583511211134,89 ± 0,824011911437,07 ± 0,594512111837,69 ± 0,755012712039,56 ± 0,685513112240,81 ± 0,336013912843,3 ± 0,34321± 3,6308 ± 3,46N**(СЭА+КСЭ) ± SD, ** -Ср.
знач., К.Э – контрольные эритроциты33,44 ± 0,8235,39 ± 0,236,04 ± 0,8337,01 ± 0,7138,31 ± 0,7338,96 ± 0,8739,61 ± 0,7441,56 ± 0,76Таблица 6.2. Метрологические характеристики cреднего результата агрегацииэритроцитов (%) после 60 мин инкубацииВид эритроцитовАгрегации эритроцитов (%) после 60 мин инкубацииМетродогическая характеристика среднего результатаТИА-EryКонтрольные эритроцитыn=3; X ̅ = 43,3; SD = 1,1; RSD = 0,0078Х ̅±∆х ̅ = 43,3 ± 0,844% (P- 95%)ξ= 1,95 %n=3; X ̅ = 41,56; SD = 0,76; RSD = 0,957Х±̅ ∆х ̅ = 41,56 ± 1,89 % (P- 95%)ξ= 4,54 %Рис.
6.5. Оптическое микроскопическое изображение агрегации эритроцитов вкамере «Горяева»a. Контрольные эритроциты, б. ТИА загруженные эритроциты154В микроскопическом исследовании установлено, что агрегирование ТИАинкапсулированных и контрольных эритроцитов в среднем значением составляет 43,3 ± 0,844% и 41,56 ± 1,89 % (P= 95%; ξ ≤ 4,54 %) соответственно. Неагрегированных эритроцитов было 56,71% и 58,44% соответственно от общего количества подсчитанных клеток. Полученные результаты не отклоняются от показателя агрегации эритроцитов в норме на 40-60%.
На основе полученных результатов можно делать вывод, что влияние разработанного метода инкапсулированияТИА препаратов на агрегационную активность эритроцитов минимально.6.1.2. Определение размера и физико-химических свойств эритроцитовРазмер ТИА инкапсулированных и свободных эритроцитов экспериментально устанавливался с помощью спектра мутности. Метод спектра мутностиоснован на том, что свет, проходя через дисперсную систему, рассеивается навзвешенных частицах. Оптическая же плотность взвешенного зависит от размера, концентрации частиц, диспергированных в среде, длины волны используемого света и относительного показателя преломления частиц, который в свою очередь, находится в зависимости от физиологического состояния и химическогосостава частиц (эритроцитов).
Этот метод был предложен в патенте SU 1337349A1 СССР для определения размера клеток [18]. Первоначальный метод был изменен для нужд данного эксперимента и описан в Главе 2 (п. 2.4.6). Полученныерезультаты изучения физико-химических свойства инкапсулированных ЭНпредставлены в таблице 6.3 и в Приложении А (рис. 11 и 12).Оптическо-микроскопические исследования показали, что инкубацияэритроцитов с ТИА сопровождалась невыраженными изменениями эритроцитов.Установлено, что диаметр загруженных эритроцитов уменьшается на 1,0-1,5 мкмпо сравнению с незагруженными эритроцитами: (d для загруженных и незагруженных эритроцитов составлял - 7,2689 ± 0,092 мкм и 8,5525 ± 0,125 мкм (Р=95%) соответственно. Относительная погрешность среднего результата (ξ) непревышала 1,46 % (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
