Диссертация (1155054), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Выбор буфера не влияет на эффективность разделения. Концентрация буфера должна быть достаточной для поддержания рН. Ионную силу рекомендуется не повышать выше 150мМ NaCl, чтобы избежать неспецифического ионного взаимодействия с матрицей. Давление над уплотненным слоем зависит от многих параметров, включая: скорость потока, вязкостьобразца и элюента, рабочая температура, свойства частиц хроматографическойсреды, набивка колонки. Выбор длины колонки определяется объемом препарата. При обессоливании, смене буфера объем препарата может составлять 20-25 %120полного объёма колонки (VО).
Отношение высоты колонки (L) к её диаметруможет быть 10:1. При хроматографическом фракционировании молекул объёмпрепарата должен составлять 1-3 % общего объёма колонки, т.к. разрешающаяспособность колонки пропорциональна корню квадратному из её длины, то соотношение L: d колонки может достигать 100:1. В повседневной практике гельхроматографию проводят в колонках, длина которых превышает диаметр в 20-40раз.
Таким образом, по объему препарата можно выбрать объём колонки, а затемеё длину и диаметр.Идеальные размеры колонки можно определить и по формуле:=/10(4.1);где m-количество исследуемого в-ва в мг, тогда длина колонки равна 30 d.Для обессоливания и рассортировки скорость может быть до 20 мл/см2ч.Для достижения наилучшего разрешения пиков существует понятие оптимальная скорость фракционирования (VОПТ). VОПТ зависит от размеров молекул игранул, увеличиваясь при уменьшении тех и других. Как правило, рабочая скорость элюции превышает оптимальную в 5-6 раз, соответственно увеличиваетсяи объемная скорость элюции.Оборудование и реактивы для гель-фильтрации готовили, как указано вГлаве 2 (п. 2.3).Подготовка сорбента.
В эксперименте использовали различные марки сефадексы, которые выдерживали в воде очищенной в течение определённого временипри комнатной температуре. Набухший гель вносили в стеклянную колонку (1,0x 30 см) до образования слоя высотой 10 см и исследовали хроматографическоеповедение изучаемых препаратов при использовании различных элюентов. В качестве элюентов нами использованы вода очищенная, растворы натрия хлорида,натрия гидроксида и кислоты хлороводородной различных концентраций. Приэтом были установлены объёмы выхода ТИА, которые явились одним из параметров в дальнейшем определении оптимальных условий выделения препаратов121из биологических материалов.
Полученные результаты хроматографическогоповедения изучаемых препаратов показаны в таблице 4.4.Таблица 4.4. Характеристики хроматографического элюирования ТИА препаратов№ колонкиЭлюентIIIIIIIVВода очищенная0,1 М HCl0,1 М NaOH0,01 M Na-ФосфатныйбуферVо (мл)54584650Скоростьэлюента, мл/чVCR1012810Найдено(m) ± SD* мкг994,288 ± 0,3114990,682 ± 0,6800989,256 ± 0,1582991,639 ± 0,4109%99,4399,0798,9399,16VLBIIIIIIIVВода очищенная5210997,684 ± 0,620199,770,1 М HCl5010992,422 ± 0,549499,240,1 М NaOH488995,206 ± 0,901199,520,01 M Na-Фосфатный5612990,449 ± 1,137299,05буферТип геля - Сефадекс G-25; длина слоя геля (см) – 10; добавленные количества VCR и VLB –1000 мкг, * n = 3ТИА препараты VCR и VLB хорошо растворяются в воде очищенной, аполученные результаты показывают хорошую элюированность из колонки.
Водаочищенная является дешевым и эффективным элюентом для изолирования ТИАпрепаратов при помощи Сефадекс G-25.4.1.3. Распределение ТИА при гель-хроматографииДля изучения распределения VCR и VLB при гель-хроматографии учитывали результаты фармакокинетических исследований анализируемых препаратов. По данным литературы при терапии ТИА препаратами по общепринятымсхемам их содержание в крови довольно низко – в среднем 1,5-2,5 нг/мл, по этойпричине использовалась высокая доза препаратов (1,0 мг/мл) с пробами кровиобъемом 1,0 мл, которых оказалось вполне достаточно для проведения анализа.Перед проведением экспериментов по разделению проводили предварительнуюдеструкцию клеток крови путем двукратного замораживания и размораживанияпробы после того как пробы разбавляются водой очищенной до 6,0 мл.
В ходеэксперимента выявлено, что без предварительной очистки биоматериал будетзадерживаться в колонке, а также плохо элюлироваться. При этом затрудняется122обнаружение ТИА препаратов, а забор фракции также после очистки колонки затруднен. Для решения этой проблемы, полученный гемолизат фильтровали через фильтр с порами диаметром 0,45 мкм.Подготовленную пробу вводили на поверхность геля в колонке и начиналипроцесс элюирования водой очищенной. При этом ТИА препараты VCR и VLBоставались вверху колонки и медленно начинали элюлироваться, а все сопутствующие вещества плазмы или гемолизата клеток быстро выходили из колонки.В среднем выход элементов крови наблюдался с 2 по 4 фракции по 2 мл.
Скорость элюента была 6 ~ 10 мл/ч, элюаты собирали в пробирки фракциями по 2мл, ТИА выходили из колонки в 4-10 фракциях. Содержание ТИА в полученномэлюате определяли спектрофотометрически по разработанной валидированнойметодике (Глава 3).Результаты эксперимента аналогичны для всех изучаемых ТИА. Былоустановлено, что высота слоя Сефадекса, равная 20 см, достаточна для разделения ТИА препаратов и эндогенных компонентов крови и гемолизата клеток.Установлено, что Сефадексы G-50, G-100, заполненные в колонки, значительноувеличивают время элюирования.
Сефадекс G-25 является оптимальным вариантом геля с хорошим разрешением изолирования ТИА препаратов в значительнокороткое время (рис. 4.1).Для оптимизации методики, а именно в целях сокращения времени анализаи снижения количества расходуемого сорбента, изучена возможность уменьшения высоты слоя геля в колонке. Для этого было использовано количество сорбента, уменьшенное в 2 и 3 раза. Также применяли различные варианты предварительной очистки биопроб для улучшения изолирования препаратов от сопутствующих веществ.
Полученные результаты показаны на рис. 4.2 и в таблице 4.5.Все колонки, заполненные Сефадексом хранились в холодильнике при +4 0С вфосфатном буфере с pH- 7,2.123Рис. 4.1. Сравнительные элюентные хроматограммы ТИА(а, б) Сефадекс G-100 и (в, г) Сефадекс G-25, заполненные колонки (L-20 см, d- 10 мм). ТИАпрепараты изолировали из гемолизата модельного образа ТИА + эритроцитыРис.
4.2. Элюентные хроматограммы ТИА после оптимизации хроматографической колонки124Таблица 4.5. Результаты после оптимизации методики гель-фильтрации ТИА№ колонкиДлина слоя геля(см)Vо (мл)Скорость элюента, мл/чКоэффициент обнаруженияVCRIIIIII105,110848106100,994830,989280,99429VLBI10680,99768II5,1460,98998III10680,99045*Диаметр все колонки d-10 мм; элюент – вода очищенная; cорбент- Сефадекс G-25.ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 41.
Установлено, что Сефадекс G-25 является оптимальным сорбентом для изолирования ТИА препаратов из биологического материала.2. Определено, что высота слоя геля, обеспечивающая полное разделение препаратов и элементов биоматериала, должна составлять 5,1-10 см, что соответствует1,6 – 2,85 г сухого сефадекса на 2 мл пробы.3.
Оптимальная скорость элюента для хорошего разрешения пиков составляет 610 мл/ч.4. Установлено, что гидравлическое давление, равное на 10 см водного столба(980 Па), создает оптимальный градиент давления через гель высотой 10 см иподдерживает скорость элюента в дипазоне 5-15 мл/ч в зависимости от длиныслоя сорбента.5. Предварительная очистка биопроб улучшает возможность изолирования ТИАпрепаратов от сопутствующих веществ.
Экспериментально установлено, чтонаиболее полное осаждение белка плазмы крови и гемолизата клеток наблюдается при использовании 30% раствора трихлоруксусной кислоты при соотношенииосадителя и биоматериала 1:1 и времени центрифугирования, равном 5 мин.125ГЛАВА 5. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ НОСИТЕЛЕЙ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА В ОРГАНИЗМЕ ТИА ПРЕПАРАТОВ VCR ИVLBКак рассмотрено в литературном обзоре есть возможность использованияКН в качестве системы доставки VCR и VLB.
В научных публикациях пока отсутствуют сведения о применении КН для VCR и VLB. Поэтому актуальным является исследование возможности применения КН для загрузки VCR и VLB сцелью уменьшения их побочных эффектов, улучшения эффективности препарата. Перед этими поставленными задачами необходимо проводить биофармацевтический анализ для изучения характеристики взаимодействия данных препаратов с плазмой и клеточными элементами крови для разработки рациональнойметодики инкапсулирования VCR и VLB в эритроцитах.5.1. Изучение взаимодействия ТИА препаратов VCR и VLB с компонентамиплазмы и форменными элементами кровиВ данном эксперименте рассматривалось взаимодействие VCR и VLB сплазмой и форменными элементными крови in vitro.
Для обнаружения VCR иVLB применялись спектральные характеристики данных препаратов. Существуют научные исследовательские данные, что после внутривенного введения, VCRи VLB тесно связывается с белками плазмы, в том числе α1-кислым гликопротеином, альбумином, липопротеином, а также с форменными элементами крови(тромбоцитами, лимфоцитами, эритроцитами, моноцитами и т.д.) [65; 175; 261].Обьектами исследования служили образцы, описанные в Главе 2 (п. 2.1).Подготовку колонок для гель-фильтрации осушествляли, как описано в Главе 2(п. 2.4.3).Для изучения взаимодействия VCR и VLB с плазмой и форменными элементами крови приготовлены 3 типа модельных образов: Модельный образ А - (Кровь + препараты) Модельный образ Б - (Плазма + препараты) Модельный образ В – (Эритроциты + препараты)126В эксперименте использовали кровь, взятую из хвостовой вены белых беспородных крыс с соблюдением правил гуманного обращения с животными.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
