Диссертация (1155054), страница 19
Текст из файла (страница 19)
По-этому содержимое из 2 флаконов аккуратно перемещали в мерную колбу вместимостью 50 мл, объем раствора доводили до метки тем же растворителем. Оптическую плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре вмаксимуме поглощения при соответствующей длине волны (λmax-295 нм) в кювете с толщиной рабочего слоя 1 см на фоне воды очищенной. Содержание ТИА(Х, мкг) рассчитали по формулам, вычисленным по данным калибровочных графиков:ХVLB (мкг) = (А- 0,01153)/0,01923×50(3.1);Х VCR (мкг) = (А- 0,01120)/0,01954×50(3.2);Где А – оптическая плотность, исследуемого раствора.Полученные результаты показаны в таблице 3.15.Таблица 3.15.
Результаты количественного определения VCR и VLB в ГЛФ№Vinblastine sulfateВид препаратаAbs.Прак.кон(мкг/мл)Найденоmx(мг)%содержаниеМетрологическиехарактеристикирезультатов19,943Взятодля анализаm0 (мг)10001Лиофилизат0,395997,13399,710,39619,9951000999,76499,98Лиофилизат0,39820,09910001004,960100,504Лиофилизат0,39720,04710001002,360100,275Лиофилизат0,39519,9431000997,13399,71n = 5; f = 4= 100,032s = 0,08403SD = 0,34024RSD = 0,0034∆Х = 0,0087Х ± ∆х = 100,03 ±0,4332 % (P = 95%)ξ = 0,9456 %2Лиофилизат3115Vincristine sulfate1Раствор для в\в0,40219,9981000999,90599,992Раствор для в\в0,40119,9471000997,35099,743Раствор для в\в0,40420,10110001005,025100,504Раствор для в\в0,40219,9981000999,90599,995Раствор для в\в0,40320,04910001002,465100,25n =5; f = 4= 100,09SD = 0,2917s2= 0,12143RSD = 0,00292∆Х = 0,0072Х ± ∆х = 100,09 ±0,3604 % (P = 95%)ξ = 0,81026 %В полученных результатах (таблица 3.15) видно, что количественное содержание VCR сульфата в инъекционной форме для в/в введения находится впределах 99,73% - 100,45% и VLB сульфата в лиофилизате - 99,60% - 100,46% отноминального содержания в ГЛФ, при этом относительная погрешность среднего результата (ξ) не превышала 0,9456 % (P = 95%).
По требованиям USP-NF,B.Ph. 2017, EPh.8, J.Ph. XVII содержание данных препаратов в субстанции должно находиться в переделе 98-103%, а в инъекционных лекарственных формах 95-105% от указанного на этикетке. На основе полученных результатов можносделать заключение, что все ГЛФ, которые применяли для эксперимента соответствовали требованиям B.Ph. 2017, EPh.8, J.Ph. XVII.116ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ 31.
Методом ИК-спектрального анализа установлена подлинность исследуемыхпрепаратов VCR и VLB. Характерные пики на полученных ИК-спектрах препаратов совпадают с пиками на стандартных ИК-спектрах, представленных в J.Ph.XVII издания.2. Исследованы УФ-спектральные характеристики ТИА алкалоидов VCR и VLBв различных растворителях. Выбрана аналитическая длина волны и растворительвода очищенная.3.
Изучены зависимости оптической плотности от концентрации исследуемыхТИА, построены калибровочные графики и рассчитаны уравнения регрессии. Наоснове полученных данных разработаны методики количественного определенияVCR и VLB в субстанциях и лиофилизированной лекарственной форме.4. Пределы количественного определения составляют для VCR - 2,108 мкг/мл;VLB - 2,022 мкг/мл. С помощью разработанной методики установлено количественное содержание VCR в растворе для в/в - 100,09 ± 0,2917 % (ξ= 0,81026 %при P = 95%) и VLB в лиофилизате - 100,03 ± 0,4332 % (ξ= 0,9456 % при P =95%). Полученные результаты показывают, что изучаемые ТИА препараты соответствуют требованиям НД (USP-NF, J.Ph XVII, B.Ph.2017).117ГЛАВА 4.
РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕРазработка методик анализа противоопухолевых препаратов VCR и VLB(ТИА) в биологических жидкостях, в частности, в плазме и клеточной массе,явилась логическим продолжением работы.Плазма крови и гемолизат клеток представляют собой сложные гетерогенные системы, содержащие большое число эндогенных органических соединений,концентрации которых часто соизмеримы с концентрациями исследуемых лекарственных средств (VCR и VLB). В связи с этим анализ препаратов в них, какправило, проводят в два этапа.
На первом этапе полученные образцы биопробобрабатывают с целью отделения изучаемых препаратов от сопутствующих веществ эндогенного происхождения, а на втором этапе проводят идентификациюи количественное определение лекарственных веществ с помощью соответствующего инструментального метода [17; 109].4.1. Разработка методики количественного определения ТИА в биожидкостях4.1.1. Определение оптимальных условий удаления белкаГемолиз клеток проводили путём добавления к клеточной массе семикратного количества очищенной воды, а для наиболее полного гемолиза проводилизамораживание и размораживание клеточной массы.Плазму крови и гемолизат подвергали очистке от белка различными осадителями: 10, 20 и 30% хлорной кислотой; 10% раствором цинка сульфата и 0,1 Мраствором натрия гидроксида; 10, 20 и 30% растворами трихлоруксусной кислоты, а также кипячением.
Готовили пробы путем добавления к 2 мл плазмы кровиили гемолизата клеток равного количества исследуемого осадителя. Затем пробытщательно перемешивали и центрифугировали в течение 5 мин при 8000 об/мин.Полноту осаждения эндогенных компонентов крови оценивали спектрофотометрически по величине остаточной оптической плотности. С этой целью измерялиоптическую плотность супернатанта при аналитических длинах волн, выбран118ных для методик количественного определения VCR и VLB в субстанциях и лекарственной форме [109]. Величина остаточной оптической плотности (Abs)определяли при λ(max) -280 нм.В результате выполненных исследований было установлено, что наиболееполное осаждение белка плазмы крови и гемолизата клеток наблюдается при использовании 30% раствора трихлоруксусной кислоты (таблица 4.1).
При осаждении эндогенных веществ из биоматериала важное значение имеет соотношение осадителя и биоматериала. В эксперименте были изучены различные соотношения биоматериала и раствора кислоты трихлоруксусной. Исследования показали, что, как для плазмы крови, так и для гемолизата клеток, оптимальное соотношение осадителя и биоматериала составляет 1:1 (таблица 4.2).Таблица 4.1. Результаты выбора оптимального осадителя эндогенных компонентов кровиСпособ осажденияКипячение в течение 10 минут10% раствор хлорной кислоты20% раствор хлорной кислоты30% раствор хлорной кислоты10% раствор цинка сульфата +0,1 М раствор гидроксида натрия10% раствор трихлоруксусной кислоты20% раствор трихлоруксусной кислоты30% раствор трихлоруксусной кислотыВеличина остаточной оптической плотности ( Abs), (λ(max) -280 нм)Плазма кровиГемолизат клеток0,3540,3840,3300,3630,2160,2450,1290,1600,2580,2960,2440,1630,0590,3020,2010,103Таблица 4.2.
Влияние соотношения осадителя и биоматериалов на полноту осаждения белкаСоотношение осадителя ибиоматериала0,5:10,75:11:11,5:1Величина остаточной оптической плотностиПлазма кровиГемолизат клеток0,8930,9140,3340,3530,0710,1010,0680,087Для оценки влияния времени центрифугирования на полноту осажденияиспользовали временной отрезок от 3 до 15 мин при 8000 об/мин. Результатыпредставлены в таблице 4.3. Как видно из представленных данных, оптимальноевремя центрифугирования составляет 5 мин.119Таблица 4.3.
Влияние времени центрифугирования на полноту осаждения белкаВремя центрифугирования,мин351015Величина остаточной оптической плотностиПлазма кровиГемолизат клеток0,3360,3530,0690,1030,0690,1090,0680,102После проведения предварительных исследований было выяснено, что вплазме крови и гемолизате клеток содержатся соединения, которые мешают получению объективных результатов при анализе ТИА VCR и VLB. Было установлено, что действием 30% раствора трихлоруксусной кислоты не удаётся полностью избавиться от эндогенных компонентов биоматериалов, мешающих определению изучаемых представителей ТИА.
В связи с этим была исследована возможность выделения ТИА методом гель-хроматографии.4.1.2. Выбор оптимальных условий гель-хроматографического выделенияТИАПравильная подготовка образцов обеспечивает хорошее разрешение ипродлевает срок службы колонки. Состав буфера не влияет на эффективностьразделения. Образцы должны быть свободны от твердых частиц, особенно приработе с сорбентами диаметром 34 мкм или меньше (Сефадекс G-25 Superfine, G50 Superfine 10, G-100 Superfine, Superose 12, Superose 16 и др.). В гельфильтрации правильная набивка колонки имеет решающее значение. Разрешающая способность между двумя фазами увеличивается пропорционально квадратному корню длины колонки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
