Диссертация (1155054), страница 14

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 14)

Венгрия), которые былиприобретены на внутреннем рынке в городе Воронеже и отвечают всем требованиям действующей нормативной документации в России.772.3. Оборудование ИК-спектрофотометр «Avatar 360 FT- IR E.S.P.» (США); Спектрофотометр «СФ-2000-01» «ОКБ СПЕКТР - Россия» ТУ 4434-00123109231-98. Кюветы кварцевые 10 мм с оптимальным пропускающим диапазоном 190-2500 нм; Cпектрофотометр «Hitachi Ratio Beam Spectrophotometer U-1900» (Япония); Весы аналитические АДВ-200; Термостат ТС-80М-2 «МедлаборТехника» (Россия); Центрифуга ЦЛН-2; Центрифуга ОПН-8 «Дастан, КгССР»; Центрифуга СМ12 лабораторная (Армед, Россия); pH-метр 121 (СССР); pH-метр pH-200 (HM DIGITAL, США); pH-метр-150М (РУП «Гомельский завод измерительных приборов»); Целлюлозные фильтры «Milipore» 0,45, 0,22 мкм (США); Микроскоп «Levenhuk 870T» тринокуляр (КНР для Levenhuk, Inc.

- США); Рефрактометр ИРФ 454 Б2М (ОАО Казанский оптико-механический завод,Россия); Дозатор - одноканальный пипетка «Лайт» переменного объема 100-1000 мкл(Thermo Scientific США); Градуированные пипетки 1 мл, 2 мл, 5 мл, 10 мл, 25 мл, 50 мл,100 мл (ГОСТ29227-91 / ИСО 835-1-81); Центрифужные пробирки 5мл, 15 мл, 50 мл («Gongdong», Китай).Оборудование и реактивы для гель-фильтрации:Колонки стеклянные (30×1,0 см; 20×1,0 см), стеклянные палочки, филь-тровальная бумага, ножницы, воронка с пробкой. Штативы для пробирок, 10мерных и 10 немерных пробирок, пипетки.Реактивы:Сефадекс G-100, G- 50, G-25; Na-фосфатный буфер 0,01М (рН 7,2), 0,1 МHCl, 0,1 М NaOH, вода очищенная.782.4.

Методы исследования2.4.1. Методы выделение плазмы из кровиДля выделения плазмы использовали донорскую кровь или кровь животных (безпородистых крыс). В экспериментах с животными кровь получали изхвостовой вены под эфирным или хлороформным наркозом. От одной крысыбрали 2,0 мл крови в гепарираванную пробирку (1,0 мл крови – 150 мкл гепарина5000 ЭД). Собранные пробы хранили в холодильнике при +4 0С до момента использования.Донорскую кровь получали из аналитической лаборатории клиническойбольницы. Сразу после получения пробы хранили в холодильнике при +4 0С домомента использования.Заготовка плазмы осуществлялась: методом центрифугирования дозы консервированной крови и выделения из нее нативной плазмы в несколько этапов:1. Собранные пробирки выдерживали при комнатной температуре в течениеоколо 30 минут до центрифугирования.2. 10 мл гепарированной крови помещали в пробирку на 15 мл для центрифигуриравания, после балансирования центрифуги, кровь центрифугировали при4000 об/мин течение 10 мин при комнатной температуре.3.

Разделенные фракции плазмы аккуратно собирали силиконовыми пипетками,не нарушая лейкоцитарную пленку, и перемещали в чистую пробирку на 15 мл(рис. 2.1).4. Изолированную фракцию плазмы от форменных элементов крови еще разцентрифугировали при 8000 об/мин 15 мин для удаления отставших клеток изплазмы.5. После центрифугирования собирали плазму из пипеток выше уровня 5 мм,высота от дна пипетки.Содержание форменных элементов в плазме контролировали под микроскопом.Изолированные фракции плазм хранили при +4 0С до момента использования79(при необходимости изолированные плазмы фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм).Рис.

2.1. Разделение компонентов крови в процессе центрифугирования в соответствии с их плотностью (слева), изолирование плазмы (справа)2.4.2. Выделение аллогенных эритроцитовЭритроциты выделяли из периферической крови человека или крыс по методу Boyum (1968), основанному на седиментации в одноступенчатом градиентеплотности фиколл-урографина. Фиколл в данной смеси выступает как агент, агрегирующий эритроциты, а изопак (или урографин) нужен для создания изотоничности и плотности 1,077 г/см3.Этапы выделения эритроцитов: Гепаринизированную кровь разводили до 2-х кратного объёма добавлениемраствора 0,01 М Na-фосфатного буфера. В центрифужную пробирку (15 мл) собирали 3 мл (75% от объёма разведенойкрови) раствора фиколла (1,077 г/см3) и разбавленную кровь аккуратно помещали на поверхности слоя раствора фиколла. Пробирки центрифугировали при 2000 об/мин (~ 400 g) в течение 40 мин прикомнатной температуре. После центрифугирования форменные элементы фракционировали в соответствии с их плотностью: верхний слой - плазма крови, затем слой мононуклеар-80ных клеток, далее слой фиколла, следующие фракции эритроциты и гранулоциты (рис.

2.2.).а. До центрифугированияб. После центрифугированияРис. 2.2. Выделение форменных элементов крови по методу Boyum (1968) Фракцию плазмы аккуратно собирали с помощью пипетки, мононуклеарныйклеточный слой собирали чистой пипеткой и переносили в чистую пробирку. Раствор фиколла собирается аккуратно, не затрагивая фракции эритроцитов надне пробирки. Фракцию, гранулированную эритроцитами, промывали 2-х кратным объёмомраствора 0,01 М Na-фосфатного буфера и центрифугировали при 3000 об/мин 10мин при комнатной температуре.

После окончания центрифугирования супернатант аккуратно отбросили. Процедуру повторили 2 раза. После последнего промывания эритроциты суспендировали в изотоническомрастворе NaCl с содержащем 3% декстрана и хранили в холодильнике при +4 0Сдо времени использования.Перед употреблением эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин,удаляли надосадочную жидкость.

Полученный осадок эритроцитов ресуспендировали в 0,9% растворе натрия хлорида и центрифугировали при 3000 об/мин(описанную операцию повторяли не менее трёх раз). Присутствие других фор-81менных элементов в суспензии эритроцитов контролировали микроскопированием.2.4.3. Методика изучения взаимодействия ТИА препаратов VCR и VLB скомпонентами плазмы и форменными элементами кровиМетод основан на регистрации спектров поглощения в УФ-области VCR иVLB и измерении оптической плотности в максимуме поглощения при λ(макс) 295нм для VCR и λ(макс) 268 нм для VLB в воде очищенной.

Для извлечения препаратов из биологических материалов (кровь) использовалась колонка (стекляннаятрубка диаметром 10 мм и длиной 25 см), заполненная Сефадекс - G 25. Кровьвзята у крыс из хвостовой вены с соблюдением всех мер и правил по обращениюс лабораторными животными.Подготовака колонок для гель-фильтрации:5,0 г сухого Сефадекса G-25 переносили в колбу на 100 мл и перемешивали с 50 мл воды очищенной при нагревании на паровой бане в течение 1 ч, потомохлаждали до комнатной температуры.

Пробку из стекловаты встраивали в колонну с помощью стеклянной палочки. Охлажденную суспензию геля тщательноперемешивали и выливали в колонку с помощью стеклянной палочки. Колонкухорошо компактировали для однородности геля, после чего ее длина соответствовала 10 см и 5,1 см (рис. 2.3), общий объём колонки (V0) соответствовал 7,85см3 и 4,0 см3 соответственно.После наполнения колонки, через нее пропускали 50 мл раствора 0,01 МNa-фосфатного буфера и затем сразу элюлировали 100 мл воды очишенной дляуравновешивания колонки.

В качестве буфера для очистки и хранения подготовленных колонок применяли 0,01 М Na-фосфатный буфер (pH -7,2).Заполненная Сефадексом колонка может быть использована многократно:после каждого применения пропускают через нее несколько объемов элюирующего раствора (вода очишенная), затем промывают 50 мл 0,01 М Na-фосфатногобуферного раствора. После многократного использования колонки скорость82элюлирования элюента значительно снижается.

В этом случае Сефадекс отмачивали и колонку набивали заново.L - Гельслояа.б.Рис. 2.3. Хроматографические колонки, заполненные Сефадексом G-25а. Подготовка колонки; б. Готовая колонка2.4.4. Включение ТИА в клеточные носителиДля получения эритроцитарной клеточной формы VCR и VLB использовали модифицированный метод гипоосмотического лизиса [148]. С этой цельюэритроциты доноров выделяли из донорской крови с использованнием методики,описанной выше (п. 2.4.2.). Суспендированные эритроциты центрифугировали при 3000 об/мин в течение5 мин при +4°С.

Супернатант отбрасывали, полученную гранулированную клеточную массу суспендировали в 5-кратном объёме Na-фосфатного буфера при+4°С в течение 5 мин и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 5 мин прикомнатной температуре. Супернатант отбрасывали, в полученную компактную клеточную массу (1,0мл) добавляли 4-кратный объём (4,0 мл) гипотонического раствора NaCl (0,65%),охлаждённого до 0°С для проведения гипотонического лизиса, и смесь выдерживали 5 мин при 0 0С.83Далее содержимое центрифугировали при 8000 об/мин 10 мин и супернатант отбрасывали. В полученную компактную клеточную массу добавляли 8 мл(125 мкг/мл, 250 мкг/мл, 275 мкг/мл) водного стандартного раствора препарата(VCR, VLB), охлаждённого до 0°С по фракциям до полного гемолиза и все инкубировали при +4 °С в течение 20 мин.

Затем восстанавливали цельность эритроцитов добавлением 9,0 % гипертонического раствора NaCl до изотоничности.Полученную суспензию инкубировали при 37 0С в течение 30 мин. После включения препарата в эритроциты, последние дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида (0,9%), затем осаждали при 8000 об/мин в течение 10мин. Супернатант отбрасывали, полученную иммобилизированную форму препарата в эритроцитах хранили в холодильнике при +4 0С с добавлением 1,0 мл0,01 М Na-фосфатного буфера.2.4.5. Определение эффективности включения ТИА (VCR, VLB) в эритроцитыОценка эффективности включения ТИА (VCR, VLB) в клеточные носителиявляется показателем воспроизводимости технологии получения инкапсулированной формы данных препаратов. Теоретический процент максимального инкапсулирования можно ограничивать упакованным объемом эритроцитов, уровнем гематокрита эритроцитов и потерей эритроцитов в процессе инкапсуляции.Потеря эритроцитов обусловлена внутренними свойствами различных эритроцитов, и практически 100% восстановления достичь не удается.

Как правило, восстановление клеток составляет от 50 до 90% [148]. Таким образом, максимальный процент инкапсуляции для эритроцитов теоретически составляет от 35 до80%. Процент инкапсуляции рассчитывается следующим образом:Х (ин)% =* 100(2.1)mi – количество препаратов в эритроцитах (мг,мкг);M - количество добавленного препарата для инкапсулирования (мг,мкг).84Для количественного определения ТИА инкапсулированных в эритроцитахприменяли спектрофотометрический метод, для чего вначале отделяли ТИА внесколько этапов: клеточные носители подвергали полному гемолизу. Гемолизат после гемолиза отделяли путем центрифугирования. Для отделения ТИА препаратов от сопутствующих веществ применяли методгель-хроматографии для очистки и изолирования препаратов. В качестве наполнителя для хроматографической колонки применяли Сефадекс G- 25. Процесс разделения контролировали с помощью спектрофотометра СФ-200001 при длине волны 295 нм и 268 нм для VCR и VLB соответственно. Количественное содержание рассчитывали разработанным аналитическимметодом.2.4.6.

Характеристики

Список файлов диссертации