Диссертация (1155054), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Определение размера и физико-химических свойств эритроцитов0,2 мл ТИА инкапсулированных и контрольных эритроцитов инкубируютв 2,0 мл Na-фосфатного буфера с pH-7,4. Готовили исходный раствор инкубационной среды, в которой показатель преломления (µ) раствора находился в пределе 1,38-1,40 с добавлением ПЭГ- 4000. Из исходного концентрированного раствора готовили ряд разбавленных растворов с показателем преломления µср – 1,33 -1,40 с градиентом 0,01. Показатель преломления каждого раствора определяли с помощью рефрактометра ИРФ - 454 Б2М. Затем в каждую пробирку добавляли по 0,1 мл разбавленной суспензии эритроцитов и тщательно перемешивали до полного диспергирования эритроцитов.Измеряли спектральную зависимость оптической плотности каждой полученнойсуспензии в интервале длин волн 600-900 нм. Из спектральной зависимости оптической плотности (средней Abs ЭФ) определяли волновой экспонент (n) для каждой среды.
Затем, на основе зависимости√от µср , с помощью экстраполяции определяли показатель преломления эрит85роцитов (µэр),определяли по таблице n=n( ), опубликованной в монографииКленина и др. [6]. Радиус эритроцитов ( ̅ ) рассчитывается с помощью формулы [23]:̅=Где, ̅ - радиус эритроцитов (мкм; нм),сительный показатель преломления.((2.2);)– длина волны света, m - (эр /) отно-На основе полученных параметров учитывается концентрация эритроцитов в 1 см3 по формуле:N=, ∗ ∗ср К(2.3);Где, – мутность; К- Коэффициент рассеяния частиц.Изменения показателя проницаемости мембран эритроцитов (ППМЭ) впроцессе инкапсуляции изучали по изменению физико-химических показателей:концентрация сухого вещества в эритроците (%) и содержание воды в эритроците (%).Для оценки нарушений ППМЭ был рассмотрен данный показатель [12], которыйпредставляет собой отношение содержания воды в эритроците (Св) к концентрации сухого вещества в эритроците (С%).ППМЭ=СВС%(2.4);Показатель среднего объёма инкапсулированных эритроцитов (MCV) показывает изменение объёма эритроцитов в процессе инкапсуляции.
MCV рассчитывали по формуле:MCV = (V) / N(2.5);Где V – суспензия разбавленных эритроцитов, добавленная в измерительныетрубки (0,01 см3), N – рассчитанная концентрация эритроцитов в 1 см3.Расчет площади поверхности (SA) эритроцита. Для практической целиполезно найти аппроксимированные модели, которые дают формулы на основе86диаметра и толщины. Было предложено рассмотреть, что квадрат диаметра эритроцита определяет размер его площади поверхности, а толщина не оказываетбольшого влияния.
Для расчета SA использовался сфероид с вогнутой крышкоймодели эритроцитов.Объем эритроцитов (VRBC) рассчитывается по формуле:(VRBC =SARBC =Где e =√−+ )( +2(2.6);)(2.7);, t - толщина, d – диаметр эритроцита.Толщина (t) эритроцитов рассчитывается по формуле:t=(2.8).2.4.7. Методика определения осмотической резистентности ТИА загруженных эритроцитовМетодика: 0,5 мл клеточной формы, загруженных ТИА препаратами, разбавляли до 2,0 мл изотоническим Na-фосфатным буфером с pH -7,4.Готовили ряд растворов, соответствующих растворам натрия хлорида в следующих концентрациях: 0,9; 0,8; 0,7; 0,65; 0,60; 0,50; 0,40; 0,30; 0,20; 0,10%.
В10 пробирок для центрифугирования добавляли по 5,0 мл раствора и в каждуюпробирку добавляли по 0,02 мл клеточный формы, затем оставляли на 60 минпри 37 0C. Смесь центрифугировали при 2000 об /мин в течение 5 мин. Из каждой пробирки сливали надосадочную жидкость и фотометрировали при длиневолны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с длиной оптического пути 1см против контрольной пробы. Контрольная проба — надосадочная жидкость впробирке, содержащей рабочий раствор с концентрацией натрия хлорида 1%.87За полный (100%) гемолиз принимают гемолиз в пробирке с 0,1% раствором натрия хлорида. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величину экстинкции надосадочной жидкости с экстинцией, принятой за 100%, по формуле:Гемолиз (%) =, %∗ 100%(2.9);где Еi-0,1% — экстинция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1% растворомнатрия хлорида; Еx — экстинция исследуемой пробы.2.4.8.
Определение степени гемолиза ТИА инкапсулированных эритроцитов0,5 мл ТИА инкапсулированных эритроцитов инкубировали в 10 мл Naфосфатного буфера при +4 0С, +100С, +150С, при комнатной температуре. Изкаждой пробы взято определённое количество супернатанта (8 мл). 0,5 мл полученного супернатанта разбавляли до 10 мл Na-фосфатным буфером, после чегооптическую плотность полученного раствора измеряли при длине волне 540 нм.Раствором для сравнения служил 0,01 М раствор Na-фосфатного буфера. Дляконтрольной пробы применяли 0,5 мл свежеизолированных эритроцитов после 2хкратного промывания изотоническим раствором. Их инкубировали в Na-фосфатном буфере при соответствующей температуре 6 ч.
Степень гемолизарассчитывали по формуле:K (Hb) =А (ТИА ЭН)А(КЭ)(2.10);Где K(Hb) - степень гемолиза, А(ТИА-ЭН) – оптическая плотность ТИА инкапсулированных эритроцитов, АКЭ – оптическая плотность контрольных эритроцитов.2.5. Статистическая обработка результатовМетодики количественного определения разработаны на модельных смесях, в которых содержание определяемого вещества было известно. Полученныерезультаты обрабатывали в соответствии с требованиями при использовании пакета прикладных программ обеспечения «Origin Pro 2015», «Statistica 12.0» и«Microsoft EXCEL 2016».
Существенность различий средних величин оценивали88по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Мана-Уитни.1. Относительную погрешность среднего результата измерения оценивали, используя критерий распределения Стьюдента (t(P,f)):=Sх =)∑((),=,ɛ=∆. 100%,⋅ 100%,∆X = t(P, f). Sгде t (P,f) – критерий Стьюдента (табличные данные);n – число наблюдений;s2 –дисперсия;ɛ - относительная погрешность отдельной варианты;- относительная погрешность среднего результата;– средное арифметическое значение;f (степень свободы) = n-1;P – достоверность;Sх – средняя квадратичная ошибка средней арифметической.2. Расчет и статистическая оценка параметров линейной зависимости проводили по требованию ОФС.1.1.0013.15 ГФ РФ XIII изд.Статистическая оценка линейной регрессииПри использовании ряда химических и физико-химических методов количественного анализа непосредственному измерению подвергается некоторая величина у, которая является линейной функцией искомой концентрации (количества) X определяемого вещества или элемента.
Иными словами, в основе такихметодов анализа лежит существование линейной зависимости [ГФ XIII-ОФС.1.1.0013.15]:y = bx + a(2.11)89где у – измеряемая величина; х – концентрация (количество) определяемого вещества или элемента; b – угловой коэффициент линейной зависимости; а – свободный член линейной зависимости.Коэффициенты, а и b и другие метрологические характеристики зависимости (2.11) рассчитывали с использованием метода наименьших квадратов по экспериментально измеренным значениям переменной у для заданных значений аргумента х. Для количественного определения применяли уравнения линейнойзависимости калибровочного графика, построенной на основе экспериментальных данных стандартных растворов аналитической области методики. Экспериментально определяется величина коэффициента a и b для каждого калибровочного графика.
По уравнениям находили количественное содержание действующего вещества в анализате Xi.Xi =Y-(2.12);Точность разработанной методики спектрофотометрического определенияТИА установливали в сосотвествии с требованиями ОФС.1.1.0012.15 ГФ РФ XIIIиздания.90ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК СПЕКТРОФОТМЕТРИЧЕСКОГООПРЕДЕЛЕНИЯ ТЕРПЕНО-ИНДОЛЬНЫХ АЛКАЛОИДОВДля количественного определения препаратов группы ТИА в настоящеевремя наиболее часто используется метод ВЭЖХ [59; 74; 111; 113; 237; 244] (рекомендован для VCR и VLB - E.Ph.8, USP, J.Ph. 17 и др.) и его производные такие, как ВЭЖХ-УФ, ВЭЖХ-МС [199; 220], ВЭЖХ-ЭХ [84; 198], ТСХ [235; 265],спектральные методы (УФ, ИК), ЖХ-ТМС [253], ЖХ/МС-ВР [68] и др. Данныеметоды характеризуются большой трудоёмкостью, длительностью, а также высокой токсичностью используемых реактивов. В современных лабораторияхбольшое распространение получил метод ВЭЖХ, но высокая стоимость одногоанализа, трудоемкость и необходимость наличия высококвалифицированногоспециалиста для работы с хроматографом снижают возможные темпы распространения данного метода.Большее внимание исследователей привлекают оптические методы анализа, одним из которых является спектрофотомерия.
К достоинствам данного метода можно отнести высокую воспроизводимость и экспрессность. В связи сэтим были разработаны спектрофотометрические методики количественногоопределения VCR и VLB, основанные на их избирательном светопоглощении вультрафиолетовой области.3.1. Изучение спектральных характеристик VCR и VLB в ИК-областиОптические методы анализа основаны на измерениях оптических свойстввещества, проявляющихся при его взаимодействии с электромагнитным излучением.
ТИА C. Roseus обладают собственным характерным поглощением (УФспектр, ИК-спектр). В химических структурах ТИА имеются хромофорные иауксохромные группы, которые обусловливают появление полос поглощения вэлектромагнитных спектрах.Для установления подлинности изучаемых ТИА VCR и VLB были получены ИК-спектры субстанций. Полученные ИК-спектры сравнивали со стандартными спектрами [E.Ph.8; USP; J.Ph.XVII] (Приложение А. Рис. 1). Используемый91метод позволил качественно определить субстанции, а также оценить их степеньчистоты.ИсследованиеспектроввИК-областиосуществлялинаИК-спектрофотометре «Avatar 360 FT- IR E.S.P.» в области волновых чисел 4000500 см-1.
Подготовку к снятию ИК-спектров проводили следующим образом:пробы готовили методом прессования навески VCR и VLB с калия бромидом всоотношении 1:100. С этой целью 100 мг калия бромида и 1,0 мг исследуемогопрепаратов перемешивали и перетирали в течение 15 минут в агатовой ступке.Навеску полученной смеси в количестве 30 мг помещали в пресс и спрессовывали таблетку. Таблетку, содержащую исследуемый ТИА, помещали в ИКспектрометр и регистрировали спектр.
Полученные спектры представлены нарис. 3.1. При проведении сравнения данных спектров со стандартными спектрами, сопоставлены пики методом наложения пальцев (спектры сравненияJ.Ph.XVII). Спектральные характеристики исследуемых VCR и VBL по даннымИК-спектров представлены в таблице 3.1.Рис. 3.1. ИК-спектры исследуемых ТИА (VCR и VLB)92Таблица 3.1. Спектральные характеристики исследуемых VCR и VBL по даннымИК-спектровν, см-1на спектреVCRVBLИнтенсивностьДиапазон частот функциональной группы3550-335034503437средняя3500-3300292029352879средняя17251715сильная2900-24003000-28001900-16001730-1710средняя1660-1600сильная1650-15801230сильная1250-1180769сильная770-7301680165016501225775Функциональная группаПервичные и вторичные амины и амидыСпирты (связанная ОНгруппа)Амины, спиртыВалентное, СНКарбонильные соединения,валентное, -С=ОНасыщенные альдегиды, валентное, -С=ОАроматические соединенияПервичные и вторичные амины, деформационные –NHЭфиры карбоновых кислот,валентное –С-ОМонозамещенный производные бензола, деформационные, -С-НМетодом ИК-спектрального анализа установлена подлинность исследуемых препаратов VCR и VLB.
Характерные пики у полученных ИК-спектров совпадают с пиками стандартных ИК-спектров, представленных в J.Ph. XVII издания (условия получения ИК- спектров соответствовали требованиям, представленным в J.Ph. XVII издания) и в монографии Harry G Brittain - Analytical Profilesof Drug Substances and Excipients Vol.21 - 22 [49].В готовых лекарственных формах содержится вспомогательное вещество лактоза, имеющая характерные пики в ИК-спектре. ИК-спектр стандартного образца лактозы опубликован в зарубежных фармакопеях и монографии Rowe et al.[201].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
