Диссертация (1155054), страница 12
Текст из файла (страница 12)
использовали модифицированный метод гипотоническогоразведения для инкапсулирования лекарств в эритроциты с более высокой эффективностью и с наименьшим повреждением целостности эритроцитов. Процесс основан на двух последовательных разведениях, гипотонического отмывания эритроцитов с последующим концентрированием, гемофильтрования и изотонического запечатывания клетки. Установлено, что 30% лекарственного вешества загружается с 35-50% восстановлением клеток [86].Метод предварительного гипотонического набухания (Hypotonic pre-swelling)Этот метод впервые был разработан M.C.
Rechesteiner в 1975 г. [203] и изменен Jenner et al. для инкапсулирования лекарственных веществ [55; 76; 80;119; 148; 200]. Методика основана на контролируемом набухании эритроцитов вгипотоническом буферном растворе. Эритроциты набухают в гипотоническомрастворе (~0,6% NaCl) при 0 0C 5 мин. При этом эритроциты будут не повреждены, но набухнут до ~150 % от нормального объёма.
Потом набухшие эритроциты центрифугируют при низких оборотах. Супернатант отбрасывают и повторнопроводят набухание один раз, затем клетки осаждают. Лизис обнаруживают исчезновением четкой границы между клеточной фракцией и супернатантом послецентрифугирования. Тоничность клеточной смеси восстанавливают в точке лизиса путем добавления вычисленного количества гипертонического буфера. Затем клеточную суспензию инкубируют при 37 °С с гипотоническим растворомпрепарата для инкапсулирования в эритроцитах. После восстанавливают тоничность раствора для восстановления цельности эритроцитов (рис. 1.9).66Рис.
1.9. Схема основного этапа метода предварительного гипотоническогонабухания*.*- изображения подготовлено на основе информации из источников [8; 55; 143]Этот метод проще и быстрее, чем другие методы, наносит минимальноеповреждение клеткам. Препараты, инкапсулированные в эритроциты с использованием этого метода: пропранолол, аспарагиназа, циклофосфамид, кортизол21-фосфат, антитрипсин, метронидазол, левотироксин, метотрексат, инсулин,эналаприлат, изониазид и др.Компания EryDel SpA является собственником технологии «Red CellLoader» - полностью автоматизированного прикроватного биомедицинскогооборудования «EryDex System» для инкапсуляции эритроцитов методом гипотонического предварительного набухания, разработанного в 1998 году Magnani etal.
[205]. Система EryDex (EDS) используется для загрузки дексаметазона натрияфосфата (DSP) в аутологичные эритроциты, создавая конечный продукт EDS(EDS-EP), который вводится один раз в месяц пациенту. Компания утверждает,что при использовании EDS у 204 пациентов в клинических исследованиях не67было выявлено типичных побочных эффектов кортикостероидов, несмотря на ихдлительное применение [88].Метод гипотонического диализаВ процессе изотонизации получают буферную суспензию эритроцитов созначением гематокрита 70-80% и помещают в стандартную диализную сумку с10-20 кратным объемом гипотонического буфера.
Смесь перемешивают медленно в течение 2 часов. Тоничность диализной сумки восстанавливается путемпрямого добавления расчетного количество гипертонического буфера в окружающую среду или путем замены окружающей среды. Препарат может быть загружен либо растворением в изотоническом буфере в начале процедуры, либопутем добавления препарата в диализную сумку после завершения перемешивания. Нагруженные клетки имеют тот же период полураспада циркуляции, что и унормальных клеток.
Кроме того, этот метод имеет высокую эффективность инкапсулирования, около 30-50%, восстановления клетки 70-80%, высокую нагрузочную способность и возможности автоматизации и контроля переменных процесса. В настоявшее время существует полная автоматизированная система дляинкапсулирования эритроцитов. В 2006 г компания ERYTECH Pharma, разрабатывала аппарат, под названием «ERYcaps», который обеспечивает инкапсулирование эритроцитов ЛС из стандартного упакованного эритроцита, поставляемогобанками крови, с соблюдением GMP. Путем централизованного производственного процесса можно обрабатывать объем 250-350 мл упакованных эритроцитов,и процедура занимает примерно 3 часа с созданием нагруженных клеток, способных продлить период полураспада активных макромолекул [205; 217].
Компания проводила многочисленные клинические испытания с Ery-ASP для исследования его эффекта при лечении острого лимфобластного лейкоза, острого миелоидного лейкоза, рака поджелудочной железы и твердых опухолей. Другиеплатформы, такие как EryVAX, EryTOL и EryMET, разрабатываются для иммунной терапии при раке.
EryTech получила статус сиротского препарата для EryASP / GRASPA® при остром лимфобластном лейкозе, острой миелоидной лей68кемии и раке поджелудочной железы в Европе и в США. Недавно EryTech объявила об успешной инкапсуляции нового фермента, называемого метионин-γлиазой в эритроцитах [217].Метод электро-инцерции или электро-инкапсуляцииВ 1973 году Zimmermann et al.
пытался опробовать электрический импульсный метод для инкапсуляции биоактивных молекул [255]. Также данный методизвестен как электропорация [55; 76; 80; 119; 148; 200]. Он основан на наблюдении за электрическим током, приводящим к необратимым изменениям в мембране эритроцитов. В 1977 году Yow Tsong и Kinosita предложили использоватьпереходной электролиз для генерации желательной проницаемости мембраныдля загрузки лекарственных веществ в эритроциты. Сущность метода заключается в том, что суспензию эритроцитов вместе с включаемым веществом в изотоническом растворе помещают в пульсирующее электрическое поле напряженностью до 20 кВ/см при длительности импульсов от нано- до микросекунд.
Превышение трансмембранного потенциала критической величины 1В приводит квременному образованию пор в клеточной мембране. В соответствующей средеперфорация клеток идет без гемолиза, позволяя готовить эритроцитарные носители, длительно живущие in vivo. Преимуществом метода является возможностьинкапсулировать нерастворимые в цитоплазме компоненты. Этот процесс можетбыть предотвращен добавлением больших молекул (например, тетра-сахаридовстахиоза и бычий сывороточный альбумин) и рибонуклиосы.Метод эндоцитозной загрузкиЭтот метод описал Schrier et al. в 1975 году [55; 76; 80; 119; 148; 200].Эндоцитоз включает разведение одного объема для промывания эритроцитов додевяти объемов буфера, содержащих 2,5 мм АТФ, 2,5 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2 споследующей инкубацией в течение 2 мин при комнатной температуре.
Поры,созданные этим методом, закрываются с помощью 154 мМ NaCl и инкубациипри 37 °С в течение 2 мин. Захват материала происходит путем эндоцитоза. Пу-69зырек мембраны отделяет путем эндоцитоза материал из цитоплазмы, таким образом, защищая его от эритроцитов и наоборот.В результате экспериментальных исследований учёные обнаружили, чтовключение лекарственных препаратов в КН имеет ряд ценных преимуществ.
Этопрежде всего целенаправленная доставка препаратов в определенные органы иткани с созданием в них высокой терапевтической концентрации, что значительно снижает возможность возникновения различных побочных реакций от проникновения препаратов в здоровые органы. Ряд лекарственных средств при парентеральном введении связывается с белками, что исключается при включенииих в «транспортировщики». Препараты при обычных методах введения практически всегда изменяют выраженность иммунологических процессов в организме.В настоящее время исследователи фокусируют свое внимание на инкапсуляции противоопухолевых препаратов в эритроцитах или наноэритросомах(nanoerythrosomes) [39; 114; 168; 183; 207].
Эритроциты, как переносчики циркулируют in vivo в сердечно-сосудистой системе (ССС) с возможностью целенаправленной доставки к органам и тканям (печень и селезенка) и возможностьюнести большее количество инкапсулированных препаратов.Zhiguang Wu et al. [251] показали в своем исследовании, что магнитные наночастицы можно инкапсулировать (погружать) в эритроциты методом гипотонически разбавленного инкапсулирования при минимальном повреждении клеточной мембраны эритроцитов. При использовании внешнего магнитного поляи ультразвуковых манипуляций возможно управлять инкапсулированными эритроцитами. Это доказывает, что метод можно применять in vivo и in vitro в биомедицинской области [251].Aaron C. Anselmo et al. [66] в проведённых исследованиях показали, чтосферические наночастицы полистирола (200 нм или 500 нм диаметром), адсорбированного на поверхности эритроцитов (NPs-RBC), способны в высокой степени накапливаться легче, чем свободные наночастицы, минуя печень и селезёнку.
Эти методы могут применяться для получения более биоразлагаемых нано70частиц с возможностью их применения в качестве носителя доставки противоопухолевых ЛС при лёгочном раке.Che-Ming J. Hu et al. [89] в проведённых исследованиях создали системыполимерных наночастиц, замаскированных на поверхности эритроцитов дляпролонгированной циркуляции в кровотоке и установили на основе нелинейноймодели элиминации первый очевидный период полураспада (т.е. 50% частицудаляются) мембраны эритроцита, покрытого наночастицами ПЭГ в течение 9,6ч и 6,5 ч.Независимо от фармакокинетических моделей, наночастицы с RBCмембранным покрытием имеют более длительный элиминационный полураспад.RBC-мембраны с покрытием намного медленнее подвергаются естественномуклиренсу по сравнению с обычным ПЭГ-стелс покрытием. Результаты этого исследования показывают возможности применения таких модификаций для защиты системы в доставке ЛВ и самого лекарства от разрушения РЭС.
MathieuLaurencin et al. [115] в проведённых экспериментах показали многофункциональность эритроцитов, покрытых магнитными наночастицами (Fe2O3/SiO2), ивозможность применения их для доставки контрастных агентов, противоопухолевых ЛС и др.1.5.4. Действие инкапсулированных эритроцитов на опухолиКак рассматривалось в данной главе, КН обладают полезными свойствами,которые имеют важное значения при химиотерапиях. В настоявшее время приостром лимфобластном лейкозе применяются эритроциты в качестве носителядля L-аспергиназы. GRASPATM [129; 174; 217] является инкапсулированным гомогенным эритроцитарным препаратом L-аспергиназы, который применяютпротив острого лимфобластного лейкоза.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
