Диссертация (1155054), страница 18
Текст из файла (страница 18)
3.8) были рассчитаны удельные (Е1%1см) и молярные (ε) показатели поглощенияпоизвестнымформулам(ГФХIII-ОФС.1.2.1.1.0003.15;ОФС.1.1.0013.15). Результаты расчётов представлены в таблице 3.6. Рассчиталипределы количественного определения (Смин) по формуле (ОФС.1.2.1.1.0003.15;ОФС.1.1.0013.15). Установление точности (правильность и прецизионность) разработанной аналитической методики проводили в соответствии с требуемымикритериями ОФС.1.1.0012.15 по характеристикам специфичность, предел обнаружения, предел количественного определения, линейность, правильность, прецизионность и устойчивость аналитического метода.3.3.3. Определения прецизионности аналитической методикиДля эксперимента выбрали три разных концентрации в интервале 5-50мкг/мл, к которым относятся низкий уровень 10 мкг/мл, средний уровень 25мкг/мл и высший уровень 40 мкг/мл концентраций.
В каждом из трех уровнейдля измерения взяли по 3 образца (общее количество - 27 образцов) в три разныхдня. Все анализируемые растворы приготовили в одних и тех же условиях, из ко108торых находили среднее значение. Результаты представлены в таблице 3.9 и3.10.Таблица 3.9. Экспериментальные данные определения прецизионности методики(VCR сульфата)Уровень111222333Взято для анализа(мкг/мл)101010252525404040Найдено(мкг/мл)10,30 ± 0,0899,81 ± 0,0599,79 ± 0,05124,75 ± 0,03025,56 ± 0,02924,79 ± 0,05139,30 ± 0,07840,73 ± 0,07839,90 ± 0,078Найдено колич.R (%)103,5398,1097,9099,01102,299,1698,25101,8399,75Метрологическиехарактеристикиx = 100,08s2= 3,8643SD = 1,9658RSD = 0,01964% RSD (CV) = 1,9642∆Х,=4,521Х ± ∆х = 100,08 ± 1,51(P= 95%)ξ = 1,506%n (общее количество)- 27, CV- coefficient of variation (коэффициент вариации)Таблица 3.10.
Экспериментальные данные определения прецизионности методики (VLB сульфата)УровеньВзято для анализа(мкг/мл)110110110225225225340340340n (общее количество)- 27Найдено(мкг/мл)10,13 ± 0,0610,15 ± 0,0810,15 ± 0,0825,02 ± 0,0325,13 ± 0,0825,06 ± 0,1239,60 ± 0,1039,69 ± 0,0339,90 ± 0,06Найдено колич.R (%)101,31101,66100,62100,16100,1699,9598,7599,2799,66Метрологическиехарактеристикиx = 100,17s2 = 0,8572SD = 0,9258RSD = 0,00924% RSD (CV) = 0,9243∆Х=2,0924Х ± ∆х = 100,17 ±0,7407(P = 95%)ξ = 0,7394 %Полученные величины коэффициентов вариации представлены в таблице3.9 и 3.10, их значение не превышает 1,5%, что свидетельствует о сходимостирезультатов.Точность методики определяли путем добавления стандартного количества VCR и VLB в растворы для образцов 50 мкг, 125 мкг и 250 мкг после того,как были измерены значения поглощения конечных растворов и было найденосреднее значение.
Полученные результаты представлены в таблицах 3.11, 3.12.109Таблица 3.11. Экспериментальные данные определения точности методики (VLBсульфата)№ВзятоДобавленодляколичество,анализа,(мкг)(мкг) -БA1502002502003125200412520052505062505072502008250200n(общее количество)- 24Abs(А+Б)Найдено(мкг)Найденоколич.R%0,491 ± 0,0010,492 ± 0,0010,65 ± 0,0020,65 ± 0,0020,589 ± 0,0020,587 ± 0,0020,871 ± 0,0020,871 ± 0,002249,360249,880332,053332,053300,328299,288446,990446,99099,7499,95102,17102,17100,1199,7699,3399,33Метрологическиехарактеристикиx = 100,32s2= 1,3766SD = 1,1733RSD = 0,012% RSD (CV) = 1,1695∆Х=2,781Х ̅±∆х ̅ = 100,32 ± 0,9386(P= 95%)ξ = 0, 9356 %Таблица 3.12. Экспериментальные данные определения точности методики (VCRсульфата)№ВзятоДобавленодляколичествоанализа,(мкг)(мкг) -БA1502002502003125200412520052505062505072502008250200n(общее количество)- 24ПределAbs(А+Б)Найдено(мкг)Найденоколич.R%0,501 ± 0,0020,503 ± 0,0010,646 ± 0,0030,648 ± 0,0020,598 ± 0,0020,597 ± 0,0010,891 ± 0,0020,890 ± 0,002250,642251,656324,842325,865300,279299,767450,214449,702100,26100,6799,95100,27100,0999,92100,0599,93обнаруженияустановиливМетрологическиехарактеристикиx = 100,14s2 = 0,0645SD = 0,2539RSD = 0,0025%RSD (CV) = 0,2536∆Х=0,6018Х ̅±∆х ̅ = 100,14 ± 0,2031(P = 95%)ξ = 0, 2028%соответствиистребованиямиОФС.1.1.0012.15.
По уравнению калибровочного графика предел обнаружениявычисляли для VCR и VLB. Теоретическое значение ПО экспериментально подтверждено при помощи 1,0 мкг/мл раствора VCR сульфата и VLB сульфата. Полученные результаты представлены в таблицах 3.13 и на рис. в приложении А(рис.2).110Таблица 3.13. Предел обнаружения ТИА VCR и VLBПрепаратVCR sulfateVLB sulfate*ср. знач ± SDКонцентрацияисследуемогораствора(мкг/мл)1,01,0Abs*0,039 ± 0,0020,035 ± 0,001Теоретическийпредел обнаружения(мкг/мл)2,10812,0219Экспериментальноустановленный предел(мкг/мл)1,42261,22053.3.4. Определение робастности аналитической методикиПолярность растворителя и pH среды, как известно, могут влиять на электронный переход молекулы при поглощении энергии. Поэтому необходимоустановить оптимальные условия для аналитической методики по критерию pHсреды растворителя.
При определении оптимальной pH среды применяли буферный раствор с pH от 3,0 до 10. Приготовили ряд стандартных растворов VCRи VLB с концентрацией 25 мкг/мл в среде буферных растворов от pH 3 до pH 10.pH показатель дистиллированной воды и все буферные растворы измеряли при20 0С с помощью pH-метра модели 121, pH-метр-150М и pH метр 200. Результаты эксперимента представлены на рис. 3.9, 3.10 (Приложение Б, таблица 4).В эксперименте показано, что изменение показателя pH среды влияет намаксимум поглощения: в более кислой среде исчезает максимум поглощения вобласти 190-230 нм, λ(max) – 219 нм у VCR и λ(max) - 214 нм для VLB.
При этоммаксимум поглощения в области 230-300 нм изменяется батохромно, интенсивность поглощения - гипохромно (рис. 3.9, 3.10 и Приложение Б, таблица 4). Экспериментальные данные показывают, что применение дистиллированной воды(pH-5,5 при 20 0C) в качестве растворителя является оптимальным вариантом дляразработки аналитической методики.Определили отношение оптической плотности (Abs) в пиках поглощенияVCR при λ(max) 295нм и λ(max) 256нм и оптической плотности (Abs) VLB при λ(max) 268нм иλ(max) 214нм в аналитическом пределе (таблица 3.14, Приложение А, рис. 3 и 4).111Рис. 3.9. Вид УФ-спектров VCR сульфата при pH среды (pH 3-10)AbsРис.
3.10. Вид УФ-спектр VLB сульфата при pH среды (pH 3-10)112Таблица 3.14. Среднее значение отношения оптической плотности (Abs) в максимуме поглощении УФ-спектра стандартных растворов VCR и VLB (5- 50 мкг/мл)Отношения (Abs) λ(max) пределе 5-50VCR λ(max) 256нм/ λ(max) 295нмЗначение (r)̅1,0202VCR λ(max) 219нм/ λ(max) 295нм3,1892VLB λ(max) 214нм/ λ(max) 268нм3,412мкг/млМетрологически характеристикиs2 = 0,00032; SD = 0,01779RSD = 0,01742∆Х= 0,0127Х ± ∆х = 1,0202 ± 0,0127 (P = 95%)ξ = 1,246 %s2 = 0,0105; SD = 0,10248RSD = 0,03245∆Х = 0,07331Х ± ∆х = 3,1982 ± 0,0733 (P = 95%)ξ = 2,321 %s2 = 0,0196; SD = 0,1399RSD = 0,0423∆Х= 0,0127Х ± ∆х = 3,421 ± 0,1 (P = 95%)ξ = 3,026%При этом установлено, что отношение оптической плотности (Abs) в максимуме поглощении VCR λ(max) 256нм/ λ(max) 295нм составляло 1,0202 ± 0,01779 иVLB λ(max) 214нм/ λ(max) 268нм - 3,412 ± 0,1, а относительная прогрешность среднего результата (ξ) не превышала 3,026%.
Полученные результаты подтверждают закономерность подчинения закону Бугера – Ламберта – Бера в аналитическом диапазоне методики, специфичность и чистоту препаратов.В Фармакопейной Конвенции США 2011 г. описаны рекомендации приколичественном определении VCR сульфата спектрофотометрическим методомс применением аммония формиат буферного раствора, pH среды которого соответствовала pH-5 и λ(max) 292 нм. Выше описанным разработанным методомустановлено, что в качестве растворителя можно применять дистиллированнуюводу для количественного определения VCR и VLB сульфата для субстанций илекарственных форм.Экспериментальные данные показали, что при применении дистиллированной воды в качестве растворителя в УФ-спектре VCR λ(max) 295 нм и VLB 268нм, которые были выбраны в качестве оптимальных аналитических линий дляколичественного определения данных веществ.
В эксперименте показано, что113изменения показателя pH среды влияет на максимум поглощения: в более кислойсреде исчезает максимум поглощения при 219 нм для VCR и 214 нм для VLB. Наоснове экспериментальных данных получили уравнения калибровочного графика для VCR сульфата Y= 0,0195X + 0,0112 со стандартным отклонением 0,00538при R2 - 0,9997 и VLB сульфата Y = 0,0192X + 0,0115 со стандартным отклонением 0,00438 при R2 - 0,9998. Для удовлетворения требованиям ОФС, критериемприемлемости при определении линейности и правильности аналитической методики является коэффициент корреляции | r| ≥ 0,9995.
Полученные результаты(VCR сульфата| r | - 0,99985 и для VLB сульфата |r|- 0,99991) дают основаниеутверждать, что разработанная методика является достоверной и соответствуеттребованиям ОФС. Оценку правильности методики проводили по результатаманализа стандартных растворов экспериментального образца (ГЛФ). Критериемприемлемости является среднее значение % восстановления (R), которое должнонаходиться в пределах от 98 до 102%. Среднее значение процента восстановления для VCR - 100,32 ± 0,9386, VLB - 100,14 ± 0,2031(P= 95%; ξ ≤ 0,94 %) и удовлетворяет критерию приемлемости (таблицы 3.11, 3.12).3.4. Методики количественного определения VCR и VLB в ГЛФПо экспериментальным данным точность количественного определенияаналитической методики для VCR сульфата и VLB сульфата приблизительнонаходится около 100% (VLB~100,32%, VCR~ 100,14%). Поэтому можно сделатьвывод о том, что разработанная методика может применяться для количественного определения VCR сульфата и VLB сульфата с минимальной относительнойпогрешностью (ξ ≤ 0,94%) в анализе субстанций и ГЛФ в виде лиофилизата.При анализе субстанций (ГЛФ в виде лиофилизата) около 5,0 мг анализируемого ТИА (точная навеска) растворяли в воде очищенной в мерной колбевместимостью 50 мл, объем раствора доводили до метки тем же растворителем.10 мл аликвоты полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл и объем раствора доводили водой очищенной до метки.
Оптическую114плотность полученного раствора измеряли на спектрофотометре в максимумепоглощения при соответствующей длине волны в кювете с толщиной рабочегослоя 1 см на фоне воды очищенной. При анализе инъекционной лекарственнойформы VCR (раствора для инъекций по 1 мг/мл г во флаконах), в состав которого входит вспомогательное вещество манитол (Е 421), не обладающий выраженными оптическими свойствами в исследуемом диапазоне– 200 - 340 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
