Диссертация (1155054), страница 21
Текст из файла (страница 21)
Вкачестве антикоагулянта использовали гепарин в соотношении 0,1 мл к 1,5 млкрови с активностью 5000 ЕД/мл. Полученную кровь хранили в холодильникепри +4 0С до времени использования. К 1,0 мл полученной крови добавили 1,0 мгVCR сульфата и инкубировали 20 мин при 37 0С. После инкубации проводилсяполный гемолиз эритроцитов путём добавления в кровь пятикратного количества воды и полученный гемолизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин при комнатной температуре (20 0С). После центрифугирования супернатант аккуратно отбирали и переносили в центрифужную пробирку на 15 мли разбавляли очищенной водой до 6,0 мл. Полученный гемолизат нагревали при80 0С в течение 20 мин на водяной бане, а после охлаждения до комнатной температуры фильтровали через бумажный фильтр.
Полученный фильтрат еще разфильтровали через фильтр, размер пор которого составлял 0,45 мкм (Millipore).Аналогичная процедура проводилась так же для VLB. После подготовки колонки при помощи шприца модельный образец аккуратно вводили в верхний слойколонки и элюлировали с использованием воды очищенной (рис.
5.1.). Скоростьэлюента была 8 ~15 мл/ч для разных колонок и сбор фракций осуществлялся по2,0 мл. Оптическую плотность каждой полученной фракции измеряли при помощи Hitachi Ratio Beam Spectrophotometer U-1900. Полученные элюентныехроматограммы приведены на рис. 5.2. Определение ТИА препаратов в биологических жидкостях проводили по ранее разработанной методике (Глава 3). Результаты приведены в таблице 5.1.Полученные данные демонстрируют эффективное отделение VCR и VLBот сопутствующих веществ крови и плазмы в хроматографических колонках.Высота насадочного слоя влияет на разрешение и время, необходимое для элюирования.
На рисунке 5.2. видно, что разделение препаратов происходит эффективнее с хорошим разрешением с использованием воды очищенной. Скоростьэлюента может влиять на разрешение хроматографического пика (рис. 5.2).127ГемолизатПесочный фильтрГель слойРис. 5.1. Рабочая колонка с Сефадексом G-25Рис. 5.2. «Элюентная хроматограмма» - хроматографическое разделение VCR иVLB в элюированных фракциях, собранных из модельного образа А (крови)Abs – Оптическая плотность128Таблица 5.1. Количественное содержание свободного препарата в гемолизате№колонкиL(см)Взято для приготовления модельного образца(мкг)Найденоm (мкг)mср.(мкг)IIIIIIIV10105,15,11000100010001000VCR341,422358,580375,738346,181352,736359,291IIIIIIIV5,15,1101050050010001000216,564214,421444,285422,920mср %35,8635,27VLB215,49343,10433,60043,36Метрологические характеристикирезультатовy = 0,0195x + 0,0112= 35,57 %SD = 1,5372RSD = 0,04322Х ± ∆х =35,57 ± 2,444 %P = 95%ξ = 6,8721 %y = 0,0192x + 0,0115= 43,23 %SD = 0,9023RSD = 0,0209Х ± ∆х =43,23 ± 1,4347 %P = 95%ξ = 3,3189 %Оптимальной скоростью элюента является 8~12 мл/ч для колонок, длинасорбента которых составляет 10 см и 5,1 см.
Количественное содержание VCR иVLB рассчитывалось с применением уравнения калибровочного графика разработанной аналитической методики. Уравнения линейной регрессии калибровочного графика были установлены y = 0,0195x + 0,0112 для VCR и y = 0,0192x +0,0115 для VLB соответственно, где x- оптическая плотность раствора при соответствующей длине волн (295 нм для VCR и 268 нм для VLB). Фракция, в которой показатель оптической плотности превышал 1,0, для более достоверногорасчета содержания препаратов, разбавлялась водой очищенной до значения 0,11,0.
Это значение относится к пределу аналитической области разработанной методики. В данной работе использовались сверхвысокие дозы препаратов 1000мкг/мл. Эта концентрация превышает в 1666 раз для VCR и в 1235 раз для VLBте, учитавая соотношение одноразовой дозы к общему объёму крови (0,6 мкг/мли 0,81 мкг/мл), что создаются после в/в введения этих препаратов при химиотерапии.
Обнаруженное содержание свободного VCR в гемолизате (таблица 5.1) в129среднем составило 35,57% ± 2,444 (относительная погрешность (ξ) = 6,8721 %; P= 95%) и VLB в гемолизате 43,23% ± 1,4347 % (относительная погрешность (ξ) =3,3189%; P = 95%) от вводимой дозы.5.1.1. Изучение взаимодействия ТИА VCR и VLB с компонентами плазмыкровиДля определения взаимодействия ТИА препаратов с компонентами плазмыкрови был приготовлен модельный образец (Б) из изолированной плазмы крови сТИА препаратами. Изолирование плазмы проводили методом, описанным в Главе 2 (п.
2.4.1). Отделенную плазму фильтровали через фильтр с размером пор0,45 мкм. После этого 0,55 мл полученной плазмы отбиралась в чистую пробирку и добавлялся 1,0 мг препарата, затем инкубировали в течении 20 мин при 370С. Полученный образец разбавлялся водой очищенной до 2,0 мл и вводился вверхний слой колонки. Модельная проба элюирования с водой очищенной наоснове полученных данных элюентной хроматограммы представлена на рис. 5.3.Результаты эксперимента приведены в таблицах 5.2-5.4.Рис.
5.3. «Элюентная хроматограмма» - хроматическое разделение VCR и VLBв элюированных фракциях, собранных из модельного образа Б (плазма крови)130Таблица 5.2. Количественное содержание найденного препарата в плазме крови№колонкиm (мкг)НайденоR%Метрологическиехарактеристикиm (мкг)VCR338,475= 66,06SD = 0,0846340,430RSD = 0,0013339,570Х ± ∆х = 66,06 ±338,9410,1345 % (P = 95%)661,059ξ = 0,2009%VLBI699,418 69,94 X ̅ = 69,89300,582II698,479 69,85 SD = 0,0787301,521III699,658 69,97 RSD = 0,0011300,342Х̅±∆х̅=69,89±IV697,973 69,80302,0270,1252 % (P = 95%)ξ = 0,1791%* взято для приготовления модельного образца = 1000 мкгIIIIIIIV661,525659,570660,43066,1565,9666,0466,11R%СвязанноМетрологическиехарактеристики33,8534,0433,9633,89= 33,94SD = 0,0846RSD = 0,0025Х ± ∆х = 33,94 ±0,1327 % (P = 95%)ξ = 0,3911%30,0630,1530,0330,20X ̅ = 30,11SD = 0,0787RSD = 0,0026Х±̅ ∆х ̅ = 30,11 ±0,1252 % (P = 95%)ξ = 0,4158%Таблица 5.3.
Количественное содержание найденных и связанных препаратовLколонки(см)Взятодляприготовлениямодельногообразца(мкг)НайденоВ гемолизате(мкг)m (ср.)Плазме(мкг)m (ср.)5,11010001000352,736358,580660,6465,1105001000215,493433,600698,882СвязанноВ гемолизатеm ср(мкг)VCR647,264641,420VLB284,507566,400Вплазме(мкг)m(ср.)С форменными элементами кровиm(мкг)% (от вводимой дозы)64,7364,14339,354307,910302,06630,7930,2156,9056,64301,118267,882265,28226,7926,53%(отвводимойдозы)Данные в таблицах 5.2 и 5.3 показывают среднее значение найденного количественного содержания препарата в плазме крови составило для VCR 66,06 ±0,1345 % и для VLB - 69,89 ± 0,1252 % (P = 95%; ξ ≤ 0,2009%) по отношению квводимой дозе, оставшейся в связанном виде в плазме крови.
Данные, представленные в таблице 5.3, демонстрируют среднее значение найденного количе131ственного содержания связанных препаратов VCR – 33,94 % и VLB – 30,11 %при относительной погрешности среднего результата (ξ) не более 0,4158%.В таблице 5.4 показаны результаты связывания с компонентами плазмыVCR - 52,67% ± 0,54 и VLB - 53,04% ± 0,27 по отношению к общей связаннойфракции соответственно, а также с форменными элементами VCR - 47,33% ±0,54 и VLB - 46,96% ± 0,27 % (P = 95%). Относительная погрешность среднегорезультата (ξ) не превышала 1,025%.Таблица 5.4.
Количественное содержание найденного препарата в процентномсоотношении к связанному во фракции препаратуLКолонки(см)В гемолизатеmср.(мкг)m ср.(мкг)5.110647,264641,420339,354339,3545.110284,507566,400301,118301,118Связанные фракции препаратовВ плазмеС форменными элементамикрови% (от общ.Ср. %* m (мкг)% (от общ.Ср. %*связаннойсвязаннойфракции)фракции)VCR52,4352,67307,91047,5747,3352,91302,06647,09VLB52,9253,04267,89647,0846,9653,16265,28246,845.1.2.
Изучение взаимодействия ТИА VCR и VLB с форменными элементами кровиДля определения взаимодействия изучаемых ТИА с форменными элементами (эритроцитами) приготовлена модель (В) из изолированных форменныхэлементов крови и препаратов. Для изолирования клеточных элементов из кровиприменялся метод, описанный в Главе 2 (п. 2.4.2).
По окончании центрифугирования супернатант аккуратно собирали пипеткой, оставшуюся клеточную массу0,45 мл переливали в пробную пробирку с добавлением 1,0 мг препарата и инкубировали в течение 20 мин при 37 0С. После инкубации проводили полный гемолиз эритроцитов путём добавления в кровь пятикратного количества воды иполученный гемолизат центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин прикомнатной температуре (20 0С). После центрифугирования супернатант аккуратно отбирали, фильтровали через фильтр с порами d = 0,45 мкм и переносили в 10132мл пробирку, разбавляя очищенной водой до 6,0 мл. Затем, после подготовки колонки, при помощи шприца модельный образец аккуратно вводился в верхнийслой колонки.
Скорость элюента была 8 ~12 мл/ч и собирали фракции по 2,0 мл.Полученная элюентная хроматограмма представлена на рис. 5.4. Результаты эксперименты приставлены в таблице 5.5.В проведенном анализе с модельными образцами «В» подтверждаютсяданные, которые были получены в проведённом эксперименте с моделями «А» и«Б». Результаты в таблице 5.5 показывают, что препараты VCR ~ 46,91 % ±0,1073 % и VLB ~ 46,23 % ± 0,1017 % (P = 95%) взаимодействуют с форменнымиэлементами крови (эритроцитами) и остаются необнаруженными. Относительнаяпогрешность среднего результата (ξ) не превышала 0,2288%. Эти показателиприблизительно совпадают со значениями, полученными в моделях «А» и «Б».Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
