Диссертация (1155054), страница 23
Текст из файла (страница 23)
Эти показатели демонстрируют, что эффективность загрузки значительно повышаетсяпри использовании свежеизолированных эритроцитов.По данным результатам можно делать вывод, что наилучшее вариант инкапсуляции ТИА препаратов в свежеизолированные ЭН.В эксперименте обнаружено, что содержание неинкапсулированных ТИАпрепаратов в надосадочных жидкостях довольно высоко (таблицы 5.7, 5.8; Приложение А, рис. 5).
В технологическом процессе получения ТИА инкапсулиро140ванных препаратов в ЭН потери препарата значительны. С фармацевтической итехнологической точки зрения это невыгодно, поэтому разработка методики дляувеличения эффективности инкапсуляции ТИА препаратов является актуальнымнаправлением исследований.5.3.2. Изучение возможности увеличения эффективности «загрузки» эритроцитов ТИА препаратамиНекоторые физические факторы могут обусловливать пассивное проникновение веществ через мембрану: концентрационный (химический) градиент,электрохимический градиент, электростатический градиент (для процессовфильтрации), осмотический градиент, градиент растворимости на границе двухнесмешивающихся фаз, например, липидной и водной.На эффективность загрузки (ЭЗ) эритроцитов может влиять внутренне осмотическое давление и внешняя среда эритроцитов.
Создание большого переходного осмотического градиента через мембрану эритроцитов может влиять наэффективность инкапсулирования молекулы внутри эритроцитов. Рассмотренавозможность применения полиэтиленгликолей (ПЭГ) и диметилсульфоксида(ДМСО) для создания высокого осмотического градиента через мембрану эритроцитов. ПЭГ снижает агрегацию эритроцитов и обладает свойством скрыватьэпитопы антигенов мембраны клеток. Также ПЭГ обеспечивает надежную защиту от воздействия экстремальных факторов окружающей среды и минимизируетповреждения клеточных мембран.
ДМСО является апротонным растворителем иприменяется в осмотическом импульсном методе загрузки для создания большого переходного осмотического градиента через мембрану эритроцитов. В данномэксперименте высокий осмотический градиент в инкубирующей среде создавалиприменением ДМСО.5.3.2.1. Изучение эффективности загрузки ТИА препаратов в клеточные носители в среде, модифицированной ПЭГДля включения ТИА препаратов применяли метод, описанный в пункте5.2.1 данной главы. Инкапсулирование препаратов проводилось в среде, моди141фицированной ПЭГ. Для инкубирования препаратов применяли среду, модифицированную разной концентрацией ПЭГ- 400 и ПЭГ- 4000, остальные условияоставались неизменными для эксперимента.
Инкубирование проводили в среде ссоотношением содержания ТИА препаратов: ПЭГ - 1:5, 1:10, 1:20; 1:50; 1:100.Осмотическое давление в среде рассчитывали по формуле:П = CRT(5.1)где i - изотонический коэффициент раствора; C — молярная концентрация раствора, выраженная в моль/м³; R — универсальная газовая постоянная; T — термодинамическая температура раствора.Полученные результаты в таблице 5.9 (Приложение А, рис. 6) показывают, что всредах, модифицированных ПЭГ-4000 и ПЭГ-400, значительно увеличиваетсяосмотическое давление по сравнению с немодифицированной средой.Таблица 5.9. Осмотическое давление в средах при инкапсулляции ТИА в ЭНТип ПЭГДобавленноеколичествоm (мг)*ПЭГ - 4000ПЭГ - 4000ПЭГ - 4000ПЭГ - 4000ПЭГ -4000ПЭГ- 400ПрепаратVCRVCRVLBVLB10,020,040,0100,0200,040,0*1,02,21,02,0Создающееся осмотическое давление в среде(9,0 мл) **(КПа)0,71971,43942,87897,197214,394328,7886**0,31190,68620,31670,6968Осмолярность(mOsmol\l)***0,27780,55561,11112,77785,555611,1111***0,24080,52970,24450,5378Общее осмотическое давление(ПЭГ+ препарат) (mOsmol\l)VCRVCRVLBVLB1,0 мг2,0 мг1,0 мг2,0 мг0,45080,58970,86751,70083,08975,86750,80741,08531,64083,30746,085211,64080,38340,52220,80001,63343,02225,80000,8151,09341,64893,31566,093411,6490,24080,52970,24450,53780,24080,52970,24450,53780,24080,52970,24450,53780,24080,52970,24450,5378Количественное содержание ТИА в ЭН определяли методом, описанным вп 5.3.1.
данной главы, эффективность включения рассчитывали по формуле,представленной в Главе 2 . Полученные результаты представлены в таблице 5.10(Приложение, рис. 7).142Таблица 5.10. Эффективность загрузки ТИА препаратов в клеточные носители всреде, модифицированной ПЭГ№колонки*МаркаПЭГВзято дляинкубирования(мкг)СоотношенияТИА:ПЭГИнкапсулированноеколичество(мкг)ЭффективностьзагрузкиE (%)МетрологическиехарактеристикиIIIIIIПЭГ 4000ПЭГ 4000ПЭГ 40002200220022001:51:101:20VCR1190,6861428,8491445,38754,1264,9565,70IVVПЭГ 4000ПЭГ 4000220022001:501:100942,865855,48842,8638,89= 53,30SD = 12,318RSD =0,2311Х ± ∆х = 53,30 ± 15,314% (P = 95%)ξ= 28,731%1:101:201:50VLB907,671000,64808,2245,3850,0340,41IIIIIIПЭГ 4000ПЭГ 4000ПЭГ 4000200020002000= 46,11SD = 7,003RSD =0,1519Х ± ∆х = 46,11 ± 8,707IV ПЭГ 400020001:100776,8938,84% (P = 95%)VПЭГ 40020001:201117,1555,86ξ= 18,884 %* Здесь L хроматографический колонки (Cефадкс G -25) = 10 см, d = 10 мм.
Температураэлюлирования –комнатная.Полученные результаты показывают высокую эффективность загрузкиТИА препаратов в модифицированной среде ПЭГ. ЭЗ ТИА в модифицированныхсредах ПЭГ-4000 и ПЭГ-400 показывают увеличение на 10-20 % в разных случаях.В результате видно, что в модифицированной среде ПЭГ ЭЗ VCR в ЭН показывает в среднем значении 53,30 ± 15,31 % и VLB - 46,11 ± 8,71%. Относительная погрешность среднего результата ЭЗ ТИА препаратов не превышала (ξ)28,73%. Также установлено, что при высокой концентрации ПЭГ (ТИА: ПЭГ 1:50, 1:100) эффективность загрузки ТИА препаратов значительно уменьшается,при этом максимальная эффективность проявляется при соотношении ТИА:ПЭГ 1:20 для VCR - 65,70 % и VLB - 55,86%. Установлено, что модифицированная среда ТИА: ПЭГ- 1:20 является оптимальной для загрузки ТИА препаратов в ЭН методом гипотонического лизиса с предварительным набуханием.1435.3.2.2.
Изучение эффективности загрузки ТИА препаратов в клеточные носители в среде, модифицированной ДМСОДля включения ТИА препаратов применялся метод, описанный в п. 5.2.1данной главы. Инкубирование препаратов проводилось в модифицированнойсреде с содержанием 2 мг/мл ДМСО, остальные условия оставались неизмененными. Количественное содержания ТИА в ЭН определялось методом, описанным в пункте 5.3.1., эффективность включения рассчитывалась по формуле(Глава 2, п. 2.4.5). Полученные результаты представлены в таблице 5.11 (Приложение А, рис. 8).Таблица 5.11.
Эффективность загрузки ТИА препаратов в клеточные носители всреде, модифицированной ДМСО (2 мг/мл)№ колонки*Взято дляинкубирования (мкг)ЭффективностьзагрузкиE (%)2200Инкапсулированное количество(мкг)VCR1377,341III22001254,73957,03III22001325,76560,26IV22001358,65461,76V22001401,32163,702200VLB1408,10564,01I62,61Метрологическиехарактеристики= 61,07SD = 2,5821RSD = 0,4234Х ± ∆х = 61,07±3,21%(P=95%)ξ= 5,2636%= 62,43SD = 2,5288II22001287,31158,51RSD = 0,4054Х ± ∆х = 62,43±III22001398,34563,563,15%IV22001423,90864,72(P=95%)ξ= 5,040 %V22001349,08761,32* Здесь L хроматографический колонки (Cефадкс G 25) = 10 см, d = 10 мм.
Температураэлюлирования – комнатная.Полученные результаты показывают высокую эффективность загрузкиТИА препаратов в модифицированной среде c концентрацией ДМСО 2,0 мг\мл.Модифицированная среда с ДМСО показывает увеличения ЭЗ на 15 – 20 %посравнению с немодифицированной средой (при отсутствии апротонного растворителя). В модифицированной среде эффективность загрузки VCR и VLB вэритроциты составила 61,07 ± 3,21 % и 62,43 ± 3,15 % (P = 95%) соответственно,144при этом относительная погрешность среднего результата ЭЗ ТИА препаратов непревышала (ξ) 5,26 %.
По литературном данным, наиболее вероятным механизмом связывания ТИА (VCR, VLB) с эритроцитами является фиксация на клеточной мембране. Кроме того, возможно проникновение ТИА, диссоциирующих наионы, внутрь эритроцитов через белковые каналы мембраны. Известно, что молекулы ДМСО обладают амфифильностью, что позволяет им погружаться в липидную фазу биомембран, изменять ее стабильность и проницаемость для других соединений. В результате отмечено существенное увеличение инкапсулирования в среде, модифицированной ДМСО. Это подтверждает, что ДМСО значительно повышает проницаемость мембран эритроцитов и увеличивает инкапсуляцию ТИА препаратов в эритроцитарные носители по сравнению с немодифицированной средой.5.3.2.3.
Изучение эффективности загрузки ТИА препаратов в клеточные носители в среде, модифицированной АТФАТФ является основным источником энергии в эритроцитах, участвует вподдержании их формы и объема. Внутриклеточная концентрация АТФ составляет 10-3 М, а в плазме крови она не превышает 10-6 М. Энергия, выделяющаясяпри разрыве макроэргической связи АТФ, обеспечивает активный транспорт катионов через мембрану, поддержание оптимального соотношения концентрацийК+ и Na+ (поддержание нормальной работы Na+/К+ каналов), сохранение формы ицелостности мембраны эритроцита и образования мембранного потенциалаэритроцитов [161; 210; 216].
При этом, в проведенном эксперименте рассматривались характеристики загрузки ТИА препаратов в эритроцитах в присутствиевысокой концентрации АТФ (2,0 мг/мл) в инкубирующей среде. Для включенияТИА препаратов применяли метод, описанный в данной главе (п. 5.2.1). АТФимеет пик максимального поглощения в УФ-области при 260 нм (рис. 5.6), чтозатрудняет обнаружение VLB, который имеет максимум поглощения при длиневолны 268 нм.145Рис. 5.6. УФ-спектр АТФ и VLB. I – УФ-спектр АТФ в водном растворе; II – УФспектр VLB в элюенте без АТФ; III - получаемый УФ-спектр в присутствие АТФв элюентеПосле процесса гель-фильтрации, в полученном фильтрате содержаниеАТФ довольно высоко и мешает обнаружению ТИА препаратов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
