Диссертация (1155054), страница 22
Текст из файла (страница 22)
5.4. «Элюентная хроматограмма» - хроматическое разделение VCR и VLBв элюированных фракциях, собранных из модельного образа В (форменных элементов крови)133Таблица.5.5. Количественное содержание найденных и связанных препаратов сформенными элементами крови№колонкиm (мкг)НайденоR %*Метрологическиехарактеристикиm (мкг)СвязанноR%МетрологическиехарактеристикиVCRIIIIIIIV531,509531,271530,657529,99253,1553,1353,0753,00468,491= 53,09SD = 0,06752468,729RSD = 0,0013469,343Х ± ∆х = 53,09 ±470,0010,1073% (P = 95%)ξ = 0,2022%VLBI461,574538,426 53,84 X ̅ = 53,69II461,895538,105 53,81 SD = 0,1914RSD=0,0036III462,582537,418 53,42Х±̅∆х̅=53,69±IV53,70462,9950,3043 % (P = 95%)537,005ξ = 0,5667%*- взято для приготовления модельного образца – 1000 мкг46,8546,8746,9347,00X ̅ = 46,91SD = 0,06752RSD = 0,0014Х ̅±∆х ̅ = 46,91±0,1073 % (P = 95%)ξ = 0,2288%46,1646,1946,2646,30X ̅ = 46,23SD = 0,06752RSD = 0,0014Х ̅±∆х ̅ = 46,91±0,1017 % (P = 95%)ξ = 0,2200%Полученные результаты в данном эксперименте близки к результатам эксперимента, проведённого Ричард А.
Бендером и его коллегами [241]. В описанных фармакокинетических исследованиях с использованием ароматически связного радиоактивного [3-H]-VCR показано, что через 20 мин после в/в введенияпрепарат в собранной фракции, состоящей из плазмы, красных и белых кровяных телец, тромбоцитов, связывается в среднем значении на 48,2%, 48,5%, 3,3%соответственно [241]. На основе полученных экспериментальных данных, можносделать вывод, что эти результаты подтверждают высокую способность ТИАсвязываться с компонентами плазмы и форменными элементами крови.Таким образом, установлено, что ТИА препараты обладают высокой способностью связываться с компонентами плазмы и форменными элементами крови.
Выявлено, что ТИА препараты связываются с компонентами плазмы в количестве для VCR- 52,67 % ± 0,54 и для VLB- 53,04% ± 0,27 (ξ ≤ 0,1025 %; Р= 95%)от общего связывающегося количества ТИА препаратов. В эксперименте установлено, что VCR взаимодействует с форменными элементами крови (эритроцитами) - 46,91 % ± 0,1073 % и VLB - 46,23% ± 0,1017 % от вводимой дозы препа134ратов. Относительная погрешность среднего результата (ξ) не превышала0,2288%.
В соответствии с полученными экспериментальными данными можноопределить оптимальные условия для инкапсулирования ТИА препаратов вэритроцитах.5.2. Метод получения эритроцитарных клеточных форм ТИА препаратовVCR и VLB5.2.1. Включение ТИА препаратов в клеточные носителиДля получения эритроцитарной клеточной формы VCR и VLB использованмодифицированный метод гипоосмотического лизиса. Метод представлен несколькими этапами: Изолирование эритроцитов и плазмы, удаление лейкоцитов и тромбоцитов,несколько промывок суспензии эритроцитов; Гипотонический лизис эритроцитов; Полный лизис и инкапсулирование препаратов, затем повторное запечатывание и закрытие эритроцитов; Дополнительные промывки лизированных закрытых эритроцитов для удаления неинкапсулированных препаратов; Ресуспензия клеток в плазме или фосфатном буферном солевом растворе(PBS).Эритроциты изолировали с применением описанного метода в Главе 2 (п.2.4.2).
Затем 1,0 мл изолированных эритроцитов дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида и центрифугирования при 3000 об/мин в течение5 мин при +4°С (в процессе инкапсулирования применялись эритроциты, изолированные из свежевзятой крови донора).С 1,0 мл эритроцитов (компактным) проводили предварительное набухание. С этой целью к 1,0 мл эритроцитов добавляли 4,0 мл 0,65% раствора NaCl(гипоосмотический раствор), охлажденного до 0 0С. Полученную суспензиюклеток инкубировали при 0 0С в течение 5 мин и после этого центрифугировалипри 8000 об/мин в течение 5 мин (рис.
5.5).135После центрифугирования супернатант отбрасывался. К полученной клеточной массе добавляли 8,0 мл изучаемого VCR и VLB (125 мкг/мл, 250 мкг/мл,275 мкг/мл), растворённого в охлаждённой до 0°С очищенной воде. Смесь инкубировали в течение 20 мин при 4°С, затем добавляли 1/9 объёма (1,0 мл) 9,0 %раствора натрия хлорида для восстановления целостности мембраны эритроцитов и инкубировали в течение 30 мин при 37°С.После включения препарата в эритроциты, последние дважды отмывалиизотоническим раствором натрия хлорида, затем осаждали при 8000 об/мин в течение 10 мин.
Полученные эритроцитарные формы препаратов хранили с добавлением 1,0 мл Na-фосфатного буфера (pH 7,4) c 3,0 % декстрана в холодильникепри +4 0С (декстран может уменьшать высвобождение гемоглобина из инкапсулированных эритроцитов).Рис. 5.5. Основные этапы метода инкапсулирования ТИА препаратов в эритроцитарные носители1365.3. Определения эффективности включения ТИА препаратов VCR и VLB вэритроцитыПри получении инкапсулированных эритроцитарных лекарственныхформ ТИА препаратов, очень важным показателем является - эффективностьвключения (инкапсулирования) препаратов в эритроциты.
Эффективность включения ТИА препаратов рассчитывали с применением методики, описанной вГлаве 2 (п. 2.4.5).Для количественного определения ТИА препаратов в эритроцитарной лекарственной форме использовали описанную выше разработанную аналитическую методику. Для обнаружения VCR и VLB применяли УФ-спектральные характеристики данных препаратов.5.3.1. Методика количественного определения клеточных форм ТИА препаратовДля получения эритроцитарных лекарственных форм ТИА препаратовприменяли 1,0 мл изолированных человеческих эритроцитов и соответствующую терапевтическую дозу препаратов.
При этом 1,0 мл объёма изолированныхэритроцитов инкубировали с 1,0 мг, 1,5 мг, 2,0 мг, 2,2 мг препаратов VCR иVLB. Количественное содержание инкапсулированных препаратов в полученных эритроцитарных лекарственных формах с ТИА препаратами определялиразработанным методом для количественного определения ТИА в биоматериале.1,0 мл лекарственной формы, представляющей собой клеточные носители с инкапсулированными ТИА препаратами (VCR и VLB), в количестве 1,0 мг, 1,5 мг,2,0 мг, 2,2 мг подвергали гемолизу путем двукратного замораживания и размораживания. Затем добавили 7-кратное количество очищенной воды, смесь центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин. Полученный после инкубирования гемолизат и надосадочную жидкость отдельно кипятили на водяной бане втечение 10 мин.
Затем охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр с порами размером d = 0,45 мкм. К полученному фильтрату прибавляли 2 мл 30% трихлоруксусной кислоты, перемешивали и вновь цен137трифугировали 5 мин при 8000 об/мин. Супернатант собирали в чистую пробирку и нейтрализовали. Полученный супернатант количественно переносили в колонку с Сефадексом G-25, предварительно уравновешенную очищенной водой.Супернатант элюировали водой очищенной и собирали во фракции по 2,0 мл до12 фракций.
Оптическую плотность полученной фракции измеряли на спектрофотометре в максимуме поглощения при соответствующей длине волны в кювете с толщиной рабочего слоя 1 см. Содержание лекарственных веществ рассчитывали по уравнениям калибровочных графиков с использованием поправочногокоэффициента для конкретной колонки. Полученные данные, представленные втаблицах 5.6-5.8, свидетельствуют о довольно близкой степени включения исследуемых веществ VCR и VLB в ЭН.Таблица 5.6. Количественное содержание инкапсулированных препаратов в ЭН№ колонки*ХарактеристикаэритроцитовВзято дляинкубирования(мкг)Инкапсулированиепрепаратов(мкг)Эффективностьзагрузки E(%)I1100VCR385,27135,031100365,74133,252100662,34231,542200659,63929,98IПосле 1 неделиизолированияПосле 2 недельизолированияПосле 3 недельизолированияПосле 4 недельизолированияС.И1100467,93242,54IIС.И1100435,84739,62IIIС.И2100944,81644,99IVС.И2200983,41744,70IПосле 1 неделиизолированияПосле 2 недельизолированияПосле 3 недельизолированияПосле 4 недельизолированияС.И1500VLB511,96834,131500500,44933,362000620,32331,021500395,28026,351000426,56843,57IIIIIIVIIIIIIVIМетрологическиехарактеристики= 32,45SD = 2,1739RSD = 0,0670Х ± ∆х = 32,45 ±3,4566 % (P = 95%)ξ = 10,6522 %= 42,96SD = 2,482RSD = 0,0578Х ± ∆х = 42,96 ±3,946 % (P = 95%)ξ = 9,1841 %= 31,22SD = 3,5026RSD = 0,1122Х ± ∆х = 31,22 ±5,5692 % (P = 95%)ξ = 17,841%= 44,27138IIС.И1500618,52741,24SD = 2,4315RSD = 0,0549IIIС.И2000937,51946,88Х ± ∆х = 44,27 ±IVС.И2000907,69045,383,866 % (P = 95%)ξ= 8,733%С.И – Свежеизолированные эритроциты.
* Здесь и в таблице 5.7 хроматографические колонкиотличались высотой слоя сорбента (Cефадкс G-25), скоростью сбора элюента и объёмом подвижной фазы.Таблица 5.7. Количественное содержание препаратов в надосадочной жидкости№колонкиХарактеристики использования эритроцитовВзятодля инкубирования(мкг)Найденов гемолизате(мкг)(%)содержания11001100726,65466,0621001421,48967,6922001519,32769,06IПосле 1 неделиизолированияПосле 2 недельизолированияПосле 3 недельизолированияПосле 4 недельизолированияС.ИVCR706,2591100625,32556,85IIС.И1100651,92459,27IIIС.И21001124,38753,54IVС.И22001190,08154,10150065,281500985,03165,6720001325,64966,2815001086,86272,46IПосле 1 неделиизолированияПосле 2 недельизолированияПосле 3 недельизолированияПосле 4 недельизолированияС.ИVLB979,2061000562,97656,30IIС.И1500859,67457,31IIIС.И20001032,02851,601С.И20001061,85753,093IIIIIIIVIIIIIIIVIV64,21Метрологическиехарактеристики= 66,75SD = 2,0956RSD = 0,0314Х ± ∆х = 66,75 ± 3,332 %(P = 95%)ξ = 4,991%= 55,94SD = 2,6483RSD = 0,0473Х ± ∆х = 55,94 ± 4,211 %(P = 95%)ξ = 7,528%= 67,42SD = 3,3819RSD = 0,0502Х ± ∆х = 67,42 ± 5,377 %(P = 95%)ξ= 7,975%= 54,58SD = 2,6771RSD = 0,049Х ± ∆х = 54,58 ± 4,257 %(P = 95%)ξ= 7,799%139Таблица 5.8.
Сравнительные данные об эффективности включения ТИА препаратовХарактеристика ЭНПрепаратЭффективность Практическоевключениясодержаниепрепаратовв надосадочнойE(%)*жидкостиE(%)*(Х ± ∆х)Общее количество найденныхпрепаратов(Сред. зна.)(%)После изолирования 1VCR32,45 ± 3,45766,75 ± 3,33299,204 нед.С.И.VCR42,96 ± 3,94655,94 ± 4,21198,90После изолирования 1VLB31,22± 5,56967,42 ± 5,37798,644 нед.С.И.VLB44,27 ± 3,86654,58 ± 4,25798,84*- значения представлены в виде среднего значения ±∆х (P = 95%)Потеря препаратов%0,801,101,361,16В результатах видно, что эффективность включения при использованииэритроцитов после 1~ 4 недель хранения значительно уменьшается и составляетв среднем значении для VCR 32,45 ± 3,46 % и VLB 31,22 ± 5,57% (P=95%).
Относительная погрешность среднего результата (ξ) не превышала 17,84%. Каквидно из таблицы 5.6 средняя эффективность включения VCR и VLB в свежеизолированные эритроциты составляла - 42,96 ± 3,946% и 44,27 ± 3,866% соответственно. Относительная погрешность среднего результата эффективностивключения не превышала (ξ) - 9,184 % (Приложение А, рис.5). Также обнаружено, что на эффективность включения ТИА препаратов в ЭН влияет время хранения изолированных эритроцитарных носителей, так как в результате видно, чтостарые ЭН показывают значительное уменьшение эффективности инкапсуляцииТИА препаратов по сравнению со свежеизолированными эритроцитами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
