Диссертация (1155054), страница 27
Текст из файла (страница 27)
После этого, полученные суспензии ТИА168загруженных эритроцитов инкубировали при 37 0С в термостате в течении 5 мин,10 мин, 20 мин, 40 мин, 1 час, 2 ч, 4 ч, 6 ч. Затем суспензии центрифугировалипри 2000 об/мин в течение 10 мин, отбирали 0,5 мл супернатанта и разводиливодой очищенной до 5,0 мл. Для определения выделения гемоглобина из ТИАзагруженных эритроцитов после энергичного встряхивания, измеряли оптическую плотность на спектрофотометре Hitachi UV 1800 при длине волне 540 нм.Степень гемолиза эритроцитов определяли по отношению к полностью лизированной эритроцитарнной суспензии той же эритроцитарной фракции. Для анализа применяли свежеприготовленные контрольные пробы.Г(Hb%) =×100%(6.2)Где Г (Hb%) – процентный показатель выделения гемоглобина (содержание гемоглобина в пробе сравнения считали 100%), A1- оптическая плотность исследуемой пробы,- оптическая плотность пробы сравненияПриготовление проб сравнения (пр.
Срв.) – к 0,5 мл упакованных изолированныхэритроцитов добавляли 10 мл дистиллированной воды для проведения польноголизиса эритроцитов. Затем суспензии эритроцитов центифугировали при 2000об/мин в течении 10 мин. Затем 0,5 мл супернатанта отбирали и разводили водойочищенной до 5,0 мл. Полученные результаты представлены в таблицах 6.13,6.14 (Приложение Б, таблица 9) и на рис. 6.11.Результаты исследования высвобождения гемоглобина из 6 типов ТИА инкапсулированных эритроцитов показаны на рисунке 6.15.
Согласно этим данным, сопротивление эритроцитов интенсивному турбулентному потоку показывает тенденцию к уменьшению от незагруженных эритроцитов к ТИА загруженным эритроцитам.Таблица 6.13. Высвобождение гемоглобина из ТИА загруженных эритроцитовпосле энергичного встряхивания in vitrot*(ми Контрольн) ные ЭН (%)103,48 ± 0,07Выделение гемоглобина Hb% *Ery-VCR(%)Ery-VLB(%)Ery-VCR: Ery-VLB:ПЭГ 4000 ПЭГ 40001:201:20(%)(%)3,82 ± 0,08 3,89 ± 0,04 3,73 ± 0,05 3,73 ± 0,05Ery-VCRДМСО(%)Ery-VLBДМСО(%)3,88 ± 0,073,83 ± 0,116920 4,09 ± 0,09 4,28 ± 0,05 4,36 ± 0,03 4,35 ± 0,1340 4,73 ± 0,12 5,35 ± 0,06 5,49 ± 0,04 5,64 ± 0,160 5,58 ± 0,10 5,91 ± 0,08 6,03 ± 0,08 6,11 ± 0,08120 5,98 ± 0,07 6,49 ± 0,1 6,81 ± 0,04 6,53 ± 0,05240 6,32 ± 0,07 6,9 ± 0,13 7,04 ± 0,03 7,00 ± 0,05360 6,8 ± 0,077,39 ± 0,1 7,36 ± 0,1 7,25 ± 0,06n=3, *- Сред. зн ±; *- Время инкубации4,37 ± 0,055,62 ± 0,076,04 ± 0,056,47 ± 0,16,71 ± 0,057,27 ± 0,054,59 ± 0,055,97 ± 0,076,3 ± 0,056,59 ± 0,056,97 ± 0,067,37 ± 0,174,56 ± 0,056,02 ± 0,16,23 ± 0,056,64 ± 0,076,83 ± 0,17,33 ± 0,07Таблица 6.14.
Метрологические характеристики cреднего результата высвобождения гемоглобина из разных ТИА-загруженных эритроцитарных форм послеэнергичного встряхивания (после инкубации 6 ч.)Метрологическая характеристика средногорезультатаxS2SDRSD∆x*ξЭН безинкапсулирования(%)*6,80,00540,07350,010810,175282,58EryVCR(%)*7,390,01090,10440,01410,24893,37Высвобождение гемоглобина (%)EryEryEry-VLB: Ery-VCRVLBVCR:ПЭГДМСО(%)*ПЭГ4000 1:20(%)*4000 1:20(%)*(%)*7,367,257,277,370,01020,1010,0240,030,10120,10070,04910,1730,01420,01390,00680,02350,24140,24010,11710,41253,283,311,615,59EryVLBДМСО(%)*7,330,0050,07330,010010,17482,39*P=95%Рис. 6.11. График зависимости высвобождения гемоглобина из ТИА загруженных эритроцитов после энергичного встряхивания in vitro от времени170Согласно результатам, представленным в таблице 6.13, можно сделать вывод о том, что после энергичного встряхивания и 6 часов инкубации при 37 0С,выделение гемоглобина из ТИА инкапсулированных эритроцитарных форм имело среднее значение: для инкапсулированных в немодифицированной среде VCR – 7,39% ± 0,249, VLB – 7,36% ± 0,241; в модифицированной среде VCR:ПЭГ4000 1:20 – 7,25% ± 0,24 , VLB:ПЭГ4000 1:20 7,27 ± 0,117, VCR:ДМСО– 7,39 ± 0,412, VLB:ДМСО -7,26 ± 0,175 и для контрольной пробы - 6,8% ± 0,175(P = 95%).
Относительная погрешность среднего результата (ξ) не превышала5,6%. Полученные результаты показывают, что высвобождение гемоглобина изТИА инкапсулированных эритроцитов по сравнению с неинкапсулированнымиЭН имеют тенденцию к увеличению в среднем на 6%. А также высвобождениегемоглобина из ТИА инкапсулированных эритроцитов в модифицированныхсредах с ПЭГ было ниже на 1,2% по сравнению с ДМСО. Таким образом, можносделать вывод, что нарушение целостности эритроцитов в процессе инкапсулирования ТИА в ЭН минимально.6.3.
Изучение условий высвобождения гемоглобина из ТИА загруженныхэритроцитовДля изучения условий выделения гемоглобина из клеточных носителейбыли проведены следующие исследования in vitro. ЭН с включенными VCR иVLB по описанной ранее методике (п. 6.1.3) и незагруженные эритроциты дважды отмывали изотоническим раствором натрия хлорида, а затем инкубировалив изотоническом буфере при 37 0С в течение 5 мин, 10 мин, 20 мин, 40 мин, 60мин, 120 мин, 240 мин, 360 мин.
Затем каждую пробу центрифугировали при2000 об/мин в течении 5 мин и собирали определенное количество супернатанта(8,0 мл) для анализа. Содержание гемоглобина определяли спектрофотометрическим методом при длине волне 540 нм. В качестве контрольной пробы применяли изолированные эритроциты, инкубированные в Na-фосфатном буфере pH 7,4при 37 0С.
Высвобождение гемоглобина (%) из эритроцитарной лекарственнойформы учитывали по отношению к содержанию гемоглобина в контрольной171пробе (оптической плотности гемолизата 1,0 мл изолированных эритроцитов). К1,0 мл эритроцитов добавляли 9,0 мл очищенной воды и проводили полный гемолиз. Полученные данные гемолизата считали 100% выделением гемоглобина(рис.
6.12).Рис. 6.12. Высвобождение гемоглобина после 6 ч инкубации при 37 0Са. Контрольная проба; б. VCR инкапсуллированные эритроциты; в. VLB инкапсуллированныеэритроциты; г. Гемолитзат - (надосадочная жидкость гемолитзата после центифугирования,считавшаяся 100 % высвобождением гемоглобина)Таблица 6.15. Высвобождение гемоглобина из ТИА загруженных эритроцитов invitrot(мин)Выделение гемоглобинаЭН безEry-VCREry-VLB Ery-VCR: Ery-VLB: Ery-VCR- Ery-VLBинкапсу(%)*(%)*ПЭГ 4000 ПЭГ 4000ДМСОДМСОлирова1:201:20(%)*(%)*ния(%)*(%)*(%)*10 4,80 ±0,06 5,22 ± 0,08 5,41 ±0,04 4,92 ±0,04 4,98 ±0,17 5,10 ±0,17 5,22 ±0,1520 5,41 ±0,23 5,71 ± 0,45 5,77 ±0,06 5,41 ±0,23 5,53 ±0,08 5,65 ±0,12 5,83 ±0,0440 5,89 ±0,22 6,26 ± 0,13 6,44 ±0,23 5,83 ±0,04 5,95 ±0,18 6,20 ±0,23 6,38 ±0.0860 6,26 ±0,06 6,80 ± 0,17 6,99 ±0,04 6,26 ±0,04 6,44 ±0,04 6,62 ±0,04 6,68 ±0,10120 6,62 ±0,14 7,35 ± 0,18 7,47 ±0,27 6,62 ±0,24 6,80 ±0,28 7,17 ±0,14 7,35 ±0,11240 7,17 ±0,22 7,96 ± 0,04 8,2 ±0,18 7,35 ±0,09 7,47 ±0,17 7,84 ±0,04 7,96 ±0,04360 7,53 ±0,13 8,44 ± 0,09 8,69 ±0,07 7,84 ±0,04 7,96 ±0,9 8,14 ±0,08 8,38 ±0,04Abs гемолизата изолированных эритроцитов – 1,646 ± 0,006; n = 3 *- Ср.
знач. ± SD172Рис. 6.13. График зависимости высвобождения гемоглобина (%) из ТИА загруженных эритроцитов и контрольных эритроцитов при 37 0с in vitro от времениТаблица 6.16. Метрологические характеристики cреднего результата высвобождения гемоглобина из разных ТИА-загруженных эритроцитарных форм после 6 чМетрологические характеристики средногорезультатаxS2SDRSD∆x*ξЭН безинкапсулирования(%)*7,530,01780,1330,0180,334,39Высвобождения гемоглобина (%)EryEryEryEry-VLB: Ery-VCRVCRVLBVCR:ПЭГДМСО(%)*(%)*ПЭГ4000 1:20(%)*4000 1:20(%)*(%)*8,448,697,847,968,140,00830,00440,00140,00840,00570,0910,0660,0370,0910,0750,0110,0080,0050,010,090,230,160,090,230,192,671,891,162,852,3EryVLBДМСО(%)*8,380,00120,0350,040,091,04*P=95%Полученные результаты показывают, что высвобождение гемоглобина изТИА инкапсулированных эритроцитов по сравнению с неинкапсулированнымиЭН невелико и это подтверждает, что нарушение целостности эритроцитов впроцессе инкапсулирования минимально.
Согласно результатам, изложенным в173таблице 6.16 видно, что из ТИА инкапсулированных ЭН высвобождается гемоглобина в среднем 8,14 ± 0,34 % по сравнению с контрольными эритроцитами 7,53 ± 0,33 % (P=95%) после 6 ч. инкубирования при 37 0С. Относительная погрешность среднего результата (ξ) не превышала 4,4%. В результате установлено, что выделение гемоглобина из ТИА инкапсулированных эритроцитов в модифицированных средах меньше, чем инкапсулированных в немодифицированных средах (рис.
6.13). На основе полученных данных также можно сделатьпредположение, что ПЭГ может связываться с эритроцитарной мембраной и стабилизировать ее.6.4. Определение стабильности клеточных носителей и клеточных формVCR и VLB при храненииДля изучения стабильности клеточных носителей с включёнными ТИА ихинкубировали в Na-фосфатном буфере при различных температурах. Стабильность ЭН с включёнными ТИА определяли по высвобождению гемоглобина изэритроцитов при хранении. Степень гемолиза эритроцитов является показателем,который демонстрирует способность сохранять целостность эритроцитов прихранении. При высокой степени гемолиза эритроцитов теряется способность сохранять терапевтическую концентрацию ТИА препаратов.Определение степени гемолиза ТИА инкаспулированных эритроцитовпроводили как описано в Главе 2 (пункт 2.4.8).
Полученные экспериментальныерезультаты представлены в таблице 6.13 и на рис. 6.14 (Приложение А, рис. 14,15).Таблица 6.17. Степень гемолиза ТИА инкапсулированных эритроцитарных формпри хранении в разных условияхФормаЭНЭНVCR-ЭН IVCR - ЭН IIVCR- ЭН IIIVCR- ЭН IV1 деньТемпература 0С41020K(Hb)K(Hb)K(Hb)1,0281,0571,4151,1891,2361,7641,1421,2831,8111,2081,2641,8491,2261,3111,7833 деньТемпература 0С41020K(Hb)K(Hb)K(Hb)1,7641,849 2,0571,9432,342,8112,0382,283 2,7831,9812,255 2,8112,0852,302 2,7646 деньТемпература 0С41020K(Hb)K(Hb)K(Hb)2,283 2,528 3,0282,887 3,094 3,5752,915 3,123 3,4722,843,283 3,6982,925 3,104 3,528174VLB- ЭН I1,1421,2261,868VLB- ЭН II1,2081,2641,915VLB- ЭН III1,2451,3021,868VLB- ЭН IV1,1891,3211,849*Abs- контрольный эритроцит - 0,1092,0472,0661,9622,0752,2172,2552,2922,2452,7172,6792,8022,6982,9062,9253,0092,9723,173,2263,2833,1983,4723,4813,4913,604Рис. 6.14. Степень гемолиза VCR инкапсулированных эритроцитов после хранения в Na-фосфатном буфере (pH-7,4) при +4 0Са.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
