Диссертация (1150303), страница 10
Текст из файла (страница 10)
УникальнойособенностьюЭОП является плоский профиль потока в капилляре, который способствует уменьшениюразмывания зон разделяемых веществ. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) – самыйраспространенный вариант КЭ, где ионогенные компоненты смеси движутся сразличными скоростями по капилляру, образуя дискретные зоны [169].
Результирующаяподвижность частиц μ определяется суммой электрофоретической и электроосмотическойподвижностей (7):μэфμ = μ эф + μ эоп,(7)μэф= q /6πηr,(8)определяют по (8):q – заряд иона, Кл; η- вязкость раствора, Па*с; r – радиус частицы, см.Электрофоретическая подвижность ЭОП определяется по (9):μэоп = ζ·ε/η ,(9)ε – диэлектрическая константа;ζ – величина дзета-потенциала (характеризует заряд поверхности капилляра).На практике μобщ рассчитывают из экспериментальных данных по (10):μобщ = Lэфф·Lобщ/U·tмигр,(10)Lобщ– общая длина капилляра (от входного до выходного конца), см;Lэфф – эффективная длина капилляра (от входного конца до зоны детектирования), см;U – величина рабочего напряжения, В;tмигр – время миграции компонента, с.Качественной характеристикойаналитаявляетсявремя миграции, аколичественной – высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества.55Эффективность в капиллярном электрофорезе может быть определена по (11) илинепосредственно из электрофореграммы (при условии гауссовой формы пика) (12):N = (Lэфф·U·μэф)/(2·D·Lобщ),(11)μэф- электрофоретическая подвижность компонента,Lэфф –эффективная длина капилляра,смLобщ – общая длина капилляра, смU – величина рабочего напряжения, ВD – коэффициент диффузии вещества.N = 5,54·(tm/w1/2),(12)tm – время миграции компонента, с,w1/2 – ширина пика на половине высоты, см.Теоретически значение N превышает величину эффективности, полученную напрактике, поскольку в уравнении учитывается не только продольная диффузия:компоненты пробы с низкими коэффициентами диффузии образуют более узкие пики.Среди факторов, влияющих на эффективность в электрофорезе, важно отметить высокоенапряжение и, как следствие, омическое и джоулево нагревание, адсорбция на стенкахкапилляра, приводящая к искажению формы пиков, а также электромиграционноеразмывание: имеет место при высокой концентрации аналита и проявляется приполучении треугольных пиков на электрофореграмме.При разделении компонентов 1 и 2 селективность (α) определяется выражением(13):α = μ1/μ2,(13)μ1- электрофоретическая подвижность компонента 1,μ2 – электрофоретическая подвижность компонента 2 [169].Мицеллярная электрокинетическая хроматография (МЭКХ) – разновидность КЭ,основанная на распределении аналита между подвижной фазой (буферным электролитом)и псевдостационарной (мицеллы).
Мицеллы образуются в растворе при превышениикритической концентрации мицеллообразования (ККМ) за счет агрегации молекул ПАВ.Мономерная и мицеллярная формы анионного детергента (например, ДДСН) практическине взаимодействуют со стенками кварцевого капилляра. Мицелла и проба движутся вовзаимно противоположных направлениях, и компоненты пробы распределяются междурабочим буфером и псевдостационарной мицеллярной фазой.56«Окном миграции» в МЭКХ называют временной промежуток между временеммиграции мицелл (tmc) и ЭОП (t0), существование которого лимитирует количество пиков(число соединений), которые могут быть разрешены в определенных условиях.
На размерокна миграции можно влиять изменением концентрации органической добавки в фоновыйэлектролит, использованием «подавителей» ЭОП и смешанных мицелл.Фактор удерживания в МЭКХ (k)может быть определен по (14):k = nmc/naq,(14)nmc– количество аналита, включенного в мицеллы;naq – количество аналита в водной фазе.Время миграции аналита рассчитывают по (15):tR = ((1+k)/1+(t0/tmc).k).t0,(15)t0 и tmc – времена миграции маркера ЭОП и мицелл, соответственно [168].Благодаря высокой эффективности, простоты автоматизации и совмещения с МСдетектированием метод КЭ становится одним из основных наряду с ВЭЖХ и ГХ методомразделения биологически активных соединений.
Однако электрофоретическое разделениеосновных аналитов (например, полиаминов, пептидов, белков, катехоламинов и др.)нередко затруднен из-за взаимодействия разделяемых соединений с силанольнымигидроксильными группами внутренних стенок кварцевого капилляра. Это приводит кневоспроизводимости параметров миграции, низкой эффективности и высоким пределамобнаружения указанных аналитов.Хорошо зарекомендовавшим себя подходом для устранения сорбции аналитовявилось создание ковалентно привитых или физически-адсорбированных покрытийстенок капилляра, экранирующих группы «ОН».
В качестве таких покрытий могут бытьиспользованынизкомолекулярные (силаны, метакрилаты с терминальными амино- иаммонийными группами, ПАВ, ЦД и т.д.) и высокомолекулярные (поливиниловыеспирты, метилцеллюлоза, полиакриламид и т.д.) соединения[170-176]. Разработкаразличных типов покрытий стенок капилляра в КЭ до сих пор остается активной областьюисследования, что подтверждается и количеством публикаций, вышедших в 2016 г. [177179] и посвященных изучению возможностей для этой цели фуллеренов, циклодекстринови различных полиэлектролитных катионных полимеров в этой области.Стабильность ковалентных покрытий ограничена устойчивостью ковалентныхсвязей, с участием которых модификаторы прививаются к поверхности капилляра в57кислой и щелочной среде. Физически адсорбированные покрытия, в особенности наоснове полимерных соединений,- прекрасная альтернативаковалентным.
Онихарактеризуются легкостью и экспрессностью получения, а зачастую - и стабильностью вшироком диапазоне рН. Физически адсорбированные покрытия создаются промывкойкапилляра перед анализом. При высоких константах адсорбции модификаторов на стенкахкапилляра создаваемые покрытия не требуют постоянного обновления, и последующиеанализы могут проводиться в фоновом электролите, не содержащем модификатор.
Анализвтакихусловияхможетбытьсовмещенсмасс-спектрометрическим(МС)детектированием, поскольку модификаторы (ПАВ, полиэлектролитные полимеры и т.д.)не присутствуют в фоновом электролите и не оказывают влияние на ионизациюразделяемых компонентов и не загрязняют ионный источник [180]. Азотосодержащиеполисахариды, например, хитин и хитозан за счет множества амино- и гидрокси- группявляются весьма перспективными соединениями для создания таких покрытий стеноккапилляра [181,182].
В [183] рассмотрен в качестве примера спермин-графт-декстрановыйполимер (рис.3.2), в котором спермин выполнял роль «якоря», связывающегомодификатор с поверхностью капилляра, а декстран – «функциональной части»,отвечающей за новые характеристики поверхности. Капилляр промывали в течение 2 мин1%-ным раствором полимера. Возможности полученного покрытия продемонстрированынаэлектрофоретическомразделениикатехоламиновибелковэффективность N ~ 200 000 – 500 000 т.т.)Рис.4.2. Схема синтеза спермин-графт-декстранового полимера [183].58(достигнутаяII.4.3.
Методы on-line концентрирование в капиллярном электрофорезеИз-за малого объема вводимой пробы и короткого светового пути, что связано смалым диаметром капилляра, метод КЭ с УФ детектированием характеризуетсязначениями пределов обнаружения,превышающими ВЭЖХ в 2-3 раза. Одним изнаиболее эффективных способов увеличения концентрационной чувствительности в КЭявляетсяприменениеразличныхвариантоввнутрикапиллярного(on-line)концентрирования [168]. По механизму концентрирования различают варианты:- основанные на изменении электрофоретических подвижностей аналитов;- основанные на использовании псевдостационарной фазы.Выделяют такие разновидности on-line концентрирования как стэкинг, свипинг,динамический pH-скачок и изотахофорез, механизм концентрирования в которыхподразумевает наличие различных свойств раствора пробы и фонового электролита.Фактор эффективности концентрирования (SEF – stacking efficiency factor),используется для количественной оценки степени концентрирования аналитов.
Егорассчитывают на основании высот (SEFheight) или площадей пиков (SEFarea) (16,17):SEFh=(16)SEFarea=(17)∆ - коэффициент разбавления.Cтэкинг с усилением поляМеханизм концентрирования при стэкинге с усилением поля основан на различияхв электропроводности матрицы образца и рабочего буфера. Проба из раствора с меньшейэлектропроводностью, чем у фонового электролита, гидродинамически вводится вкварцевый капилляр. Ионы образца имеют большую электрофоретическую подвижность врастворе с более низкой проводимостью, чем в рабочем буфере.
По этой причине послеприложения напряжения к концам капилляра в зоне пробы возникает сильноеэлектрическое поле. Аналиты ускоряются до границы с фоновым электролитом,достижение которой вызывает их торможение аналитов, и разделяемые соединенияконцентрируются на границе в виде узких зон. Эффективность концентрированияпропорциональна степени усиления поля (γ): чем больше разница концентраций междубуферным электролитом и раствором пробы, тем уже зона сконцентрированной пробы59(18). Когда градиент проводимости исчезает, сконцентрированные зоны подвергаютсяобычному электрофоретическому разделению (18).Lstack=,(18)Lввод – первоначальная длина зоны пробы (мм),Lstack – длина зоны пробы после стэкинга (мм),γ – отношение силы электрических полей в растворе пробы и буферным электролите.Модификацией этого метода является стэкинг с усилением поля с водной пробкой.Перед дозированием образца вводится водная «пробка».
На выходном конце капилляраформируется зона высокого поля, что позволяет ввести заряженные аналиты с высокойскоростью. Для достижения более высоких факторов концентрирования и эффективностиварьируют время ввода водной пробки и раствора анализируемого образца.ЭлектростэкингЭлектростэкинг – стэкинг с усилением поля при электрокинетическом вводепробы.Большойобъемпробы,растворенныйвнизкопроводящейматрице,электрокинетически вводят в кварцевый капилляр. Таким образом, имеет местоселективный ввод пробы: в большем количестве в капилляр будут вводиться текомпонентысмеси,которыеимеютнаибольшиезначенияэлектрофоретическихподвижностей. Количество аналита (Ni), введенное в капилляр, может быть рассчитанопо(19):Ni (tввод) = ACi(μЭОП + γμэфi)Eotввод,(19)A – площадь сечения капилляра, см2;Сi – концентрация аналита в пробе, моль/л;γ – отношение силы электрических полей в растворе пробы и буферном электролите,рассчитывается по уравнению (18);μЭОП – подвижность ЭОП, см2/В∙с;μэфi– электрофоретическая подвижность иона аналит, см2/В∙с;tввод – время ввода пробы, c;Eo – сила электрического поля в системе КЭ (В/см).Для использования данного варианта концентрирования необходимо, чтобыскорость ЭОП была много меньше электрофоретической подвижности аналитов.
Приэлектростэкинге можно эффективно сконцентрировать только катионные или анионныеаналиты и в большей степени - ионы с высокой электрофоретической подвижностью.Степени концентрирования превышают соответствующие величины по сравнению с60гидродинамическим вводом [168]. Основной недостаток электростэкинга – ограниченныйобъем вводимой пробы. Введение водной «пробки» или органического растворителяперед дозированием образца и в этом случае позволяет значительно увеличить факторыконцентрирования (до 200000).Стэкинг с большим объемом вводимой пробыПри анализе следовых количеств аналитов в реальных объектах методом КЭ-УФчасто приходится прибегать к введению большого объема пробы в целях увеличенияконцентрационной чувствительности. Для концентрирования аналитов в этом случаенеобходимо удалять матрицу вводимой пробы в целях элиминирования неоднородностираспределения силового поля и скорости ЭОП [184].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
