Диссертация (1150303), страница 9
Текст из файла (страница 9)
В качестве модельной смеси использовали метилвилоген и фенол49(при 200-300 нм); фенол в условиях эксперимента служил маркером ЭОП. Показано, чтопри электрофоретическом разделении этой смеси на фторированном этиленпропиленовомкапилляре эффективность для метилвиологена значительно выше и составляет 55300т.т./м, а для фенола – 22500 т.т./м (рис.3.21.).Рис. 3.20. Электрофореграммы модельной смеси белков при одновременном присутствиицвиттер-ионного и катионного фторированного ПАВ в концентрациях (а) 100 и 10 мкг/мл, (б) 25 и50 мкг/мл, (с) 100 и 50 мкг/мл, (d) 400 и 50 мкг/мл [135].Рис.3.21. Электрофореграммы смеси метилвиологена и фенола с использованиемфторированного капилляра (А) и необработанного кварцевого капилляра (Б) [138]50Фторсодержащиесоединения,применяемыевхроматографическихиэлектрофоретических методах, могут выполнять функции стационарных фаз, а такжедобавок в фоновый электролит и элюент, приводя к лучшей селективности разделения иэффективности.
Однако эти полимерные материалы, наряду с уникальной инертностьюи стабильностью, обладают высокой гидро- и олеофобностью,ограничивающихприменение подобных материалов в методах разделения из-за их низкой растворимостив водно-органических фазах. Модификация фторполимеров введением различныхфункциональных групп могла бы обеспечить решение этой проблемы.II.4. Характеристика методов и объектов анализаII.4.1. Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)Разделение веществ в тонкослойной хроматографии (ТСХ) основано на различии вскорости перемещения компонентов смеси в плоском слое (толщина 0,1-0,5 мм) сорбентапри их движении в потоке элюента. Подвижная фазаправило, жидкость.Вкачестве н.ф.
используютпредставляет собой, какмелкозернистыйсиликагель,Аl2О3, целлюлозу, крахмал, полиамид, иониты и др. Появление сорбентов с диаметромпор5-7мкмпривелокразвитиюметодавысокоэффективнойхроматографии [139], а его сочетание с видеоденситометрическимтонкослойнойдетектированиемобеспечивает возможность проведения количественного анализа сложных объектов.II.4.1.1.
Параметры удерживания в ВЭТСХ, эффективность и селективностьразделенияПоложение пятен по окончании анализа определяется значением Rf (ratio of fronts,retention factors, retardation factor). Значения факторов удерживания зависят от свойствразделяемых аналитов и природы подвижной и стационарной фаз. Величина Rf (1)является индивидуальной характеристикой соединения, хроматографируемого в данномрастворителе в условиях опыта, и изменяется от 0 до 1:Rf = Zm/Zr,(1)Zm – расстояние, пройденное веществом от стартовой линии до центра пятна (мм);Zr - расстоянии, пройденное элюентом от стартовой линии до фронта (мм).Факторудерживания,k–безразмернаявеличина,характеризующаяпродолжительность нахождения молекул определяемого соединения в неподвижной фазе(tR) относительно времени их пребывания в подвижной фазе (tm):51k = (Zm - Zr)/Zr(2)Эффективность в ТСХ определяется числом теоретических тарелок, котороеможно рассчитать по (3):N = 16*( Zm/w)2,(3)w– ширина пятна (см); Zm– путь, пройденный аналитом (см),или высотой, эквивалентной теоретической тарелке (Н):H = L/N,(4)L – длина хроматографической зоны разделения, см.Селективность (a) – способность конкретной системы «растворитель – сорбент» кхроматографическомуразделениюпарывеществ.Онаоцениваетсяфакторомселективности (5):a1/2 = (D2/D1) = (1/Rf1–1)/( 1/Rf2–1),(5)D1, D2 – коэффициенты распределения аналитов между подвижной и неподвижной фазами(1 – наиболее удерживаемый компонент смеси, а 2 – наименее).Факторы разрешения рассчитывают по (6):Rs= l(Rf2 – Rf1)/[(w1 + w2)0,5](6)l– расстояние от старта до фронта; w - ширина пятна (мм), 1- наиболее удерживаемыйкомпонент смеси, 2 – наименее [139].Тонкослойная хроматография часто используется для проведения экспрессного,простого и не требующего дорогостоящего оборудования разделения компонентов смесии их идентификации.
Однако в связи со сравнительно небольшой длиной разделяющейзоны (3-10 см) метод ТСХ характеризуется недостаточной селективностью разделения иразрешением. Эта проблема в ряде случаев решается использованием сорбентов сразмером частиц порядка 5-6 мкм (ВЭТСХ). Одним изперспективных подходов кувеличению селективности разделения аналитов остается применение импрегнированныхразличными органическими и неорганическими модификаторами стационарных фаз, атакже введение их в элюент. Импрегнирование стационарной фазы проводят либопогружением ТСХ пластины в раствор модификатора, либо распылением его на пластинус помощью пульверизатора и последующей просушкой пластины.
Такого рода покрытиястационарной фазы называют статическими. Так, в [140] пластины, содержащие сульфаткальция, использовались для разделения недериватизированных полиаминов, являющихся52сложными объектами для ОФ ВЭЖХ анализа из-за высокой полярности аналитов.
Намодифицированных пластинах удалось отделить орнитин (Rf 0.2) и цитрулин (Rf 1.3) откадаверина (Rf 0.93), спермина (Rf 0.85) и спермидина (Rf 0.85). Анализ проходил на 1/3быстрее по сравнению c использованием силикагелевых пластин (рис.4.1.).Рис.4.1. Разделение орнитина (1), цитрулина (2) и кадаверина(3), спермина (4) испермидина (5) на пластинах, модифицированных сульфатом кальция; п.ф.
– метанол [140].Динамическое покрытие создается при введении модифицирующего агента вподвижную фазу. Создаваемые таким образом покрытия стационарной фазы зачастуюполучаются неоднородным и плохо воспроизводимыми [141].В качестве модифицирующих агентов могут выступать соли различных металлов(Sn(IV), Ag(I), Cu(II), Bi(III) и Ca(II)) [142-144], хиральные соединения (карбоновыекислоты [145,146], аминокислоты [147], сахара [148]), ЦД [149-151] и ПАВ [152-154].Присутствие в элюенте мицелл ПАВ обеспечивает наличие дополнительной фазыдля перераспределения разделяемых аналитов [155, 156]. В [157] выявлены возможностикатионного и анионного ПАВ в концентрации, превышающей ККМ, введенных в п.ф.
вВЭТСХ при разделении парацетомола и диклофенака натрия. Выбранная система (н.ф. –силикагель; п.ф. метанол + 0,1% ЦТАБ + уксусная кислота) оказалась подходящей и дляопределения диклофенака натрия в моче. Другой пример применения ПАВ в ВЭТСХприведен в [158], где показана возможность определения стероидных гормонов в образцахмочи здоровых доноров и пациентов с синдромом Иценко-Кушинга.Хиральное разделение в ВЭТСХМетод ВЭТСХ является быстрым, простым, недорогим и доступным дляпроведения анализа в любой лаборатории.
Кроме того, он позволяет проводитьодновременный анализ сразу нескольких образцов. Именно поэтому ВЭТСХ являетсяпрекрасной альтернативой ВЭЖХ, КЗЭ и ГЖХ для мониторинга энантиочистоты53фармпрепаратов. Кроме того, он может быть использован для препаративного разделенияэнантиомеров.Наиболее часто используемыми добавками в элюент или стационарную фазу приразделении энантиомеров являются циклодекстрины [159-162], особенностями которыхявляется стабильность в широком диапазоне рН и отсутствие поглощения в УФ и видимойобласти. Разделение аналитов в основном обусловлено образованием комплексоввключения. Основными факторами, влияющими на комплексообразование, являются Вандер-Ваальсовы и гидрофобные взаимодействия, образование водородных связей междувторичными гидроксильными группами и находящимися вблизи от хирального центрааналита заместителями. Многие производные ЦД обладают лучшей растворимостью иэнантиоселективностью.
Среди них гидроксиэтил-β-ЦД, гидроксипропил-β-ЦД , диметилβ-ЦД и др. Степень замещения в производных может также влиять на механизмэнантиоразделения.В[163]показанывозможности2-гидрокси-3-триметилпропиламмоний-β-ЦД, а также немодифицированного β-ЦД и карбоксиметил-βЦД в качестве добавок в элюент при разделении энантиомеров аминоглутатемида.Показано, что факторы энантиоселективности существенно зависят от состава подвижнойфазы, рН среды и природы производных β-ЦД.Макроциклические антибиотики, например, ванкомицин, образуют другой классхиральных селекторов, которые также активно используются в ТСХ [164, 165]. Разделениеэнантиомеров в этом случае основано на совокупности различных видов взаимодействий:кулоновские и стерические, образование комплексов включений и межмолекулярныхводородных связей.Разделение может проводиться в различных режимах: нормально- и обращеннофазовом; в полярной органической или полярной ионной среде.
Выбор п.ф. влияет на то,какие связи будут преобладать в хиральном распознавании. Строгих доказательствмеханизмов комплексообразованияпока что нет. Обсуждаются различные гипотезы.Например, в [166] утверждается, что для аминокислот ионные взаимодействия междуаммонийной группой макроциклического пептидного селектора и анионом карбоксильнойгруппы аминокислоты являются ключевыми. Напротив, в [167] установлено, чтоэнантиомеры аминокислот могут быть разделены на TAG-хиральной стационарной фазе(агликона тейкопланин), в которой одна N-концевая аминокислота селектора используетсядля связывания через мочевину, и, следовательно, доступных аминогрупп нет.54II.4.2. Метод капиллярного зонного электрофореза и мицеллярнойэлектрокинетической хроматографииВ методе КЭ разделение компонентов смеси происходит в фоновом электролите,заполняющем кварцевый капилляр, при приложении к нему разности потенциалов идетектировании в потоке жидкости.
Разделение осуществляется за счетразличий вэлектрофоретических подвижностях аналитов (μ), которые зависят заряда и величиныионного радиуса [168].Добавление катионных ПАВ (например, цетилтриметиламмоний бромида (ЦТАБ))вфоновый электролит приводит кперезарядке внутренних стенок капилляра из-заадсорбции ЦТАБ, и ЭОП обращается в направлении анода.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
