Диссертация (1150303), страница 13

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 13)

Способ ввода пробы: гидродинамическийили электрокинетический. Смена проб – автоматическая с автосемплером на 10входных и 10 выходных пробирок. Промывка капилляра – автоматическая. Снабженкварцевым капилляром с внешним полиимидным покрытием (внутренний диаметр 75мкм, общая длина 60 см, эффективная длина 50 см). Сканирующий электронный микроскоп HITACHI S3400N.Обработка результатов экспериментов проводилась с помощью программногообеспечения«Денситометр Сорбфил» (ООО «Сорбполимер», г.

Краснодар, ВЭТСХ),«Totalchrom» («Perkin-Elmer», ГЖХ) и «Эльфоран» («Люмэкс», КЭ).72Рис.1.1. Блок-схема прибора «КАПЕЛЬ 105М»Средства измерений:Микрошприц «Hamilton» (10 мкл), США.Микродозаторы переменного объема вместимостью 200-1000, 0,5 – 10 мм3,предел допускаемой погрешности измерения не более ±5%.Лабораторный рН-метр рН 211, Hanna Instruments.Аналитические весы “Sartorius” (d = 0.001 мг (0.5 г)).Вспомогательные устройства и материалы:ТСХ-камеры (10х10 см).Хроматографические пластинки «Sorbfil» ПТСХ-АФ-В-УФ (г.Краснодар).Пробирки для микропроб Эппендорфа полипропиленовые вместимостью 1 –2 мл.Нагревательные столики для ТСХ «УСП – 1М», температурный диапазон: 0– 1200С.Ультразвуковая баня Branson 1510.Центрифуга настольная для малых объёмов УПХ-8 УХЛ.III.2.

Растворители и реагентыАцетонитрил («Криохром» сорт 0 и 3); метанол (х.ч.) («Реахим»); хладон-113(Кирово-Чепецкий химический комбинат, техн.); гексафторпропилен (Кирово-Чепецкийхимический комбинат, ТУ 95-129-78); этилен (“Мониторинг”); гексафторбензол (Кирово73Чепецкий химический комбинат, х.ч.); ледяная уксусная кислота (х.ч. «Реахим»);диметилформамид (СК «Гранд»); тетраэтоксисилан (х.ч.) («Реахим»); циклогексан (х.ч.)(«Реахим»); диэтаноламин (х.ч., «Biochem»), бензол (х.ч.) («Реахим»); толуол (х.ч.)(«Реахим»); этанол (х.ч.) («Реахим»); пропанол (х.ч.) («Реахим»); изопропиловый спирт(х.ч.) («Реахим»); бутанол-1 (х.ч.) («Реахим»); бутанол-2 (х.ч.) («Реахим»);2-метилпропанол-1 (х.ч.) («Реахим»); хлористый метилен (х.ч.) («Реахим»); тетрахлорметан(х.ч.) («Реахим»); диэтиловый эфир (х.ч.) («Реахим»); бутанон (х.ч.) («Реахим»);этилацетат (х.ч.) («Реахим»); диоксан (х.ч.) («Реахим»); ацетонитрил (х.ч.) («Реахим»);нитрометан (х.ч.) («Реахим»); триэтиламин («Невареактив» х.ч.); муравьиная кислота(х.ч.) («Реахим»); ацетат аммония («Sigma»); концентрированная соляная кислота(«Векторн»); соль медного купороса («Sigma»);карбонат натрия (х.ч.) («Реахим»);дигидрофосфат натрия (х.ч.) («Реахим»); гидрофосфат натрия (х.ч.) («Реахим»);фосфорная кислота (х.ч.) («Реахим»); борная кислота (х.ч.) («Реахим»); гидроксид натрия(ч.д.а.)(«Химреактив»);нингидрин(ООО«Вектон-М»);додецилсульфатнатрия(«Sigma»); цетилтриметиламмонийбромид (ч.д.а, «Sigma»), дейтерохлороформ (ООО«Астрохим», 99,8%), ацетон-D6 (ООО «Астрохим», 99,8%).

Cоли аммоний фтористый,литийхлористый,калийсернокислый,натрийуглекислыйбезводный,натрийазотистокислый, натрий азотнокислый, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия,бромид натрия, а также оксид хрома (VI) (х.ч. «Реахим», Санкт-Петербург). Органическиекислоты: молочная, щавелевая, янтарная, лимонная, яблочная и винная (х.ч. «Реахим»,Санкт-Петербург).Аминокислоты: L-лизин, глицин, L-валин, L-триптофан, D/L-триптофан, Lтирозин, D/L-тирозин, L-глутаминовая кислота, L-пролин фирмы «Sigma».Водорастворимые витамины: рибофлавин («Sigma»), тиамин хлорид рибофлавин-5фосфат натрия, пиридоксина гидрохлорид, цианокобаламин и аскорбиновая кислота(водные раствор витаминов в ампуле 50, 0,2, 50, 0,2, 50 мг/мл соответственно,«Мосхимфармпрепараты»).Стероидныегормоны:кортизол,кортизон,кортикостерон,11-норметанефрин(NM),дезоксикортикостерон, 11-дезоксикортизол фирмы «Sigma».Катехоламины:допамин(DA),эпинефрин(E),норэпинефрин (NE) фирмы «Sigma».Белки: альбумин человеческий сывороточный (Alb, pI 4.7, Mw 66241 г/моль),миоглобин из конских скелетных мышц (Myo, pI 7.0, Mw 17800 г/моль), трансферин изплазмы крови человека (Trf, pI 5.8, Mw 79550 г/моль), лизоцим из куриного яичного белка(Lys, pI 11.0, Mw 14300 г/моль) фирмы «Sigma».74β-блокаторы: карведилол («Sigma», 98%);(S)-(-)пропранолол гидрохлорид(«Sigma», 98%); (±)-пропранолол («Sigma», 98%); (±)-соталол гидрохлорид («sigma»,98%).Лекарственные препараты: акридилол (активный компонент – карведилол,«Акрихим»,Россия),анаприлин(активныйкомпонент–пропранолол,«Татхимфармпрепараты», Россия), сотагексал (активный компонент –соталол, «Hexal»,Германия).В качестве модификаторов хроматографических (ВЭТСХ) и электрофоретических(КЭ) систем, выступали: высокофторированныеполимеры,являющиесясополимерамиэтиленаифтормономеров с различными функциональными группами (сложноэфирными,фторсульфатными и сульфонилфторидными), а также полученные в результатеполимераналогичныхпревращений(ссульфонатными,карбоксилатными,сульфамидными, N,N-диэтилкарбамидными и N,N-диэтиламино группами); синтезэтих полимеров описан в разделе III.6. сверхразветвленные полимеры на основе полиэтиленимина (PEI) с массой ядра 5кДа с различной степенью функционализации олигосахаридами (структуры А 77%,В 32% и С 16%) и природой терминальных групп (мальтоза (Mal), лактоза (Lac)).Полимеры далее по тексту обозначаются как PEI- Mal/Lac –A/B/C- 5/25кДа. водная безэлектролитная суспензия наноанионита типа АВ-17х8 в ОН-форме(НИА): размеры частиц 50-250 нм, концентрация по функциональным группам 43мМ, по твердой фазе ~ 20 г/л; частицы анинита получены в научной группе А.М.Долгоносова [3].III.3.

Приготовление стандартных растворовСтандартные растворы β-блокаторов готовили растворением точных навесок: 1мгкарведилола в 1 мл смеси CH3OH:H2O (1:1,объемн.), 1 мг соталола в 1 млсмесиC2H5OH:H2O (1:1,объемн.), и 1 мг пропранолола в 1 мл дистиллированной воды.Стандартные растворы аминокислот готовили растворением точных навесоккаждого вещества (6 мг) в дистиллированной воде. Подготовленные растворы хранили вхолодильнике при +4-6оС.Рабочие растворы (2 мг/мл) готовили разбавлениемдистиллированной водой стандартных растворов в три раза сиспользованиемавтоматического дозатора. Полученные растворы до анализа хранили в холодильнике при+4-6оС.75Стандартные растворы катехоламинов (допамин, эпинефрин, норметанефрин,норэпинефрин) готовили растворением 1 мг вещества в 1мл 0,1 М раствора солянойкислоты.

Растворы белков готовились растворением в 1 мл дистиллированной воды 4 мгвещества.Рабочие растворы готовили разбавлением стандартных и реальных объектов спомощью автоматического дозатора. Концентрации рабочих растворов были выбраны всоответствии со способностью аналитов поглощать свет в УФ области и составляли:пропранолол – 0,5 мг/мл и 0,05 мг/мл; карведилол – 1 мг/мл; соталол – 0,8 мг/мл; тирозин(Tyr) – 1 мг/мл и 0,5 мг/мл; триптофан (Trp) –0,2 мг/мл; допамин (DA), эпинефрин (E),норметанефрин (NM),норэпинефрин (NE) – 25 мкг/мл, альбумин, миоглобин,трансферрин, лизоцим – 1 мг/мл.Стандартные водные растворы витаминов брали из ампул. Рабочие растворывитаминов В1, В6 и С готовили разбавлением содержимого ампул дистиллированнойводой в 10 раз, В2-разбавлением в 50 раз.

Раствор витамина В12 из ампулыиспользовали в качестве рабочего (Табл.3.1). Значения рабочих концентраций витаминоввыбирались согласно их способности к абсорбции света в УФ области.Таблица.3.1. Исходные и рабочие концентрации водорастворимых витаминовВитаминС исх., (мг/мл)С раб., (мг/мл)Тиамин хлорид (В1)505Рибофлавин фосфат натрия (В2)100,2Пиридоксин хлорид (В6)505Цианокобаламин (В12)0,20,2Аскорбиновая кислота (С)505Стандартные растворы стероидных гормонов кортизола (F), кортизона (E),кортикостерона (B), 11-дезоксикортикостерона (DOC), 11-дезоксикортизола (S) (1 мг/мл)готовили растворением точных навесок каждого из стероидов (1 мг) в 1 мл ацетонитрилаво фторопластовых закрывающихся пробирках.

Рабочие растворы (20 мкг/мл дляэкспериментов в условиях КЭ) получали разбавлением стандартныхв 50 раздистиллированной водой с помощью автоматического дозатора. Растворы хранили вморозильной камере при -200С.Стандартные растворы органических кислот и солей неорганических кислотготовилирастворением точной навески вещества (1 мг) в 1 мл деионизованной воды впластиковых микропробирках объемом на 1,5 мл. Рабочие растворы готовили76разбавлением стандартных с помощью автоматического дозатора и составляли: 50,0мкг/мл, 5,0 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,05 мкг/мл.III.4.

Пробоподготовка реальных объектов к анализуБиологические жидкости:Пробыкровиотбиралисьввакутейнер,содержащийгепарин,затемцентрифугировалась в течение 10 минут при 3000 об./мин. Плазму отбирали и хранили вморозильной камере при -40°С. Пробы разовой мочи (утренняя средняя порция),отбиралась в стерильный пластиковый контейнер хранилась в морозильной камере при 40°С. Пробы слюны отбирали в пластиковую полипропиленовую пробирку типа«Эппендорф». Хранили в холодильной камере при температуре 2-8 °С.Пробу плазмы крови последовательно фильтровали через бумажный истекловолоконный фильтр с размером пор 1-2 мкм, а затем мембранный (инертный кбелкам) микрофильтр с размером пор 0,22 мкм, разбавляли в 100 и 10000 раз водой дляопределения альбумина. Пробоподготовка слюны к анализу лизоцима включалацентрифугирование (3000 об/мин, 10 мин.) и разбавление в 5 и в 500 раз водой.Предварительно отфильтрованный через мембранный микрофильтр с размеромпор 0,22 мкм образец мочи разбавляли с помощью автоматического дозатора в 200 раздеионизованной водой.Фармацевтические препараты:Пробоподготовкалекарственныхпрепаратовнаосновеβ-блокаторов(«Анаприлин», «Сотагексал» и «Акридилол») заключалась в растворении точной навескив 1 мл этилового или мелтилового спиртах: «Анаприлин»: 120 мг навески, с массой пропранолола 10 мг, растворяли в 1 млэтилового спирта; «Сотагексал»: растворяли 160 мг препарата, содержащего 80 мг соталола, в 1 млэтилового спирта; «Акридилол»: 110 мг препарата, содержащего 12,5 мг рацемата карведилоло,растворяли в 1 мл спирта.Полученные растворы центрифугировали, отбирали верхний слой, фильтровалипробы через мембранный микрофильтр с размером пор 0,22 мкм и разбавляли с помощьюавтоматического микродозатора в 10 раз и использовали при последующих ВЭТСХэкспериментах.Образцы вин:77Пробоподготовка вин (белое столовое полусладкое вино - Castillos de Espana BlancoSemidulce и красное полусладкое вино – ЛЫХНЫ, Крым) включала разбавление образцовв 20 раз деионизованной водой и фильтрование через мембранный микрофильтр сразмером пор 0,22 мкм.III.5.

Приготовление растворов фоновых электролитов дляэлектрофоретических экспериментовБыли приготовлены буферные растворы следующего состава:0,3М боратные буферные растворы pH 9,0; 10,0; 11,0; 12,0 (в 40 млдистиллированной воды растворяли 0,93 г H3BO3, доводили до нужногозначения рН (по рН-метру) 1М раствором NaOH и доводили объем до 50 мл вмерной колбе);0,3 М фосфатные буферные растворы (pH 2,0; 2,5; 3,0; 4,0) (в 40 млдистиллированной воды растворяли 1,8 г NaH2PO4, доводили 0,1М растворомH3PO4 до соответствующего значения pHи доводили объем до 50 мл вмерной колбе;0,2 М фосфатный буферный раствор (pH= 5,7) готовили смешением растворов0,2М NaH2PO4 (23,7 мл) и 0,2M (3,6 мл) Na2HPO4;0,1 М ацетатный буферный раствор рН 4 (в 30 мл дистиллированной водырастворяли 0,38 г ацетата аммония и доводили до требуемого значения pHраствором ледяной уксусной кислоты).Готовые буферные растворы отфильтровывали через бумажный фильтр идегазировали на ультразвуковой бане.

Характеристики

Список файлов диссертации