Диссертация (1150303), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Концентрирование, при которомсовмещается ввод большого объема пробы с удалением её матрицы, называют «стэкингомс большим объемом вводимой пробы». Его применяют, когда направление ЭОПпротивоположно направлению миграции аналитов. Пробу растворяют в большом объеменизкопроводящей матрицы игидродинамически вводят в капилляр. За счетразнонаправленного движения аналитов и ЭОП происходит удаление матрицы пробы(растворителя), а сконцентрированные зоны аналитов двигаются за счет собственнойэлектрофоретической подвижности к выходному концу капилляра.Таким образомудается сконцентрировать аналиты в 60-100 раз [185-187].On-line концентрирование на модифицированных капиллярахВзаимодействие некоторых аналитов со стенками кварцевого капилляра, а такженизкая концентрационная чувствительность являются основными недостатками КЭ, вособенности для анализа смесей высокомолекулярных соединений (белков, полипептидов,ДНК).Дляувеличениямодифицированныхчувствительностикапилляровванализасочетаниисрекомендуетсяразличнымииспользованиевариантамиon-lineконцентрирования.
Подобные анализы удобно проводить в условиях КЭХ. Например, в[62] разработана схема получения PLOT-колонок на основе СРП с терминальнымимальтозными группами для анализа смеси белков (миоглобина, альбумина, лизоцима иинсулина). Обращенный ЭОП на модифицированных полимером капиллярах создавалблагоприятные условия для проведения стэкинга с большим объемом вводимой пробы,где противонаправленное движение аналитов и ЭОП обеспечивает «сброс» матрицыпробы и снижение ПО. Используя такой подход, авторам удалось сконцентрировать белкив 1320 раз и снизить ПО до 100-500 нг/мл, что обеспечило определение альбумина вобразцах сыворотки крови и моче без дополнительных стадий пробоподготовки.61В другом исследовании [188] on-line концентрирование ДНК проводили намодифицированных капиллярах c добавлением в фоновый электролит полиэтиленоксида(0,5%).
Отмечена высокая воспроизводимость времен миграции (СКО(%) = 0,8 – 2,2(n=4)). Применение электростэкинга обеспечило концентрирование ДНК в 100 раз.Высоты пиков ДНК увеличивались пропорционально времени ввода пробы: 5, 30, 60 с, -10кВ (рис.4.3.). При электрокинетическом вводе пробы отрицательно заряженные линейныемолекулы ДНК селективно вводятся в капилляр, заполненный фоновым электролитом исодержащим модификатор – 0,5 % полиэтиленоксид.Рис.
4.3. Электрофоретическое разделение молекул ДНК, содержащих 11, 18, 40, 80, 102,142, 174, 267, 289, 328, 434, 458 и 657 пар оснований на модифицированных полиэтиленоксидомкапиллярах с различным временем электрокинетического ввода пробы. 254 нм, -15 кВ,электрокинетический ввод пробы при -10 кВ, фоновый электролит, содержащий 0.5%полиэтиленоксид [188].II.4.4. Ионная хроматография – капиллярный электрофорезВ 1990 г. Терабе и Исемура впервые предложили решение проблемы низкойселективности разделения близких по электрофоретическим подвижностям органическихкислот.
В фоновый электролит вводились полиэлектролитные положительно заряженныеполимеры полибрен и поли(хлорид диаллилдиметиламмоний) (Рис.4.4.) [189], которые,имеяположительныйзаряд,противоположныйзарядуразделяемыханалитов,образовывали с последними ионные пары. Из-за сильного различия между константамивзаимодействия в системе «полимер-аналит» электрофоретические подвижности ионныхпар«полимер-аналит»могутсильноотличаться62дажевтомслучае,еслиэлектрофоретические подвижности свободных ионов одинаковы. Данный факт позволяетиспользовать предложенный метод для разделения изомеров [190]: при помощи«ионообменной электрокинетической хроматографии», как был впервые назван этотметод, разделены пять изомерных нафталиндисульфонатов.
Метод квалифицирован какхроматографический, т.к. в его основе различия констант ион-парных взаимодействий, ане электрофоретические подвижности анионов.Рис. 4.4. Структурные формулы а) поли(хлорид диаллилдиметиламмоний), б)полибрен, в) поли(бромид N-этил-4-винилпиридиний) [190]Позднее этот метод стали называть «ионная хроматография – капиллярныйэлектрофорез» («ion chromatography – capillary electrophoresis»)[191]. Суть егозаключается во введении в фоновый электролит растворимых полимерных положительнозаряженных модификаторов, на функциональных центрах которых происходит ионныйобмен между противоионами полиэлектролита и разделяемыми анионами.
Кроме того,введенный в фоновый электролит полимер может динамически модифицировать стенкикапилляра, приводя к обращению ЭОП [191, 192].Так, в [191] выявлены возможности поли(диаллилдиметилламмоний хлорида) дляразделения органических кислот (Рис.4.45.). Полимер выполнял функции модификатораповерхности капилляра и анионообменника: варьирование его содержания в фоновомэлектролите меняло электрофоретические подвижности анионов.Имеются публикации и по использованию заряженных полимеров для определениянеорганических анионов. В [192] наряду с поли(хлоридом диаллилдиметиламмония)рассмотрены полибрен и поли(бромид N-этил-4-винилпиридиний). Установлено, что вряду полибрен –поли(хлорид диаллилдиметиламмония) – поли(бромид N-этил-4-винилпиридиний) возрастает способность к ассоциации с анионами.
Введение в фоновыйэлектролит поли(бромида N-этил-4-винилпиридиния) позволяет в течение двух минут63определить 11 неорганических анионов, а также катионы некоторых металлов вкомплексах с ЭДТА.Рис. 4.5. Электрофоретическое разделение органических анионов с введением (А)0,3%поли(хлорида диаллилметиламмония) и (Б) 1,0% поли(хлорида диаллилдиметиламмония) вфоновый электролит (150 мМ Li2SO4, 20 мМ H3BO3, pH = 8.5); Система капиллярногоэлектрофореза WatersQuanta 4000 СЕ; 214 нм.
Ввод пробы гидродинамический: 40 с, 10 мбар.Анионы: 1 – бензоат , 2 –бензилсульфонат, 3 - п-толилсульфонат, 4 - п-аминобензоат, 5 – пгидроксибензоат, 6 – 2-нафталинсульфонат, 7 – 1-нафталинсульфонат, 8 – 3,5-дигидроксибезоат, 9– 2,4-дигидроксибензоат [191] .Имеются публикации и по использованию заряженных полимеров для определениянеорганических анионов. В [192] наряду с поли(хлоридом диаллилдиметиламмония)рассмотрены полибрен и поли(бромид N-этил-4-винилпиридиний). Установлено, что вряду полибрен –поли(хлорид диаллилдиметиламмония) – поли(бромид N-этил-4-винилпиридиний) возрастает способность к ассоциации с анионами. Введение в фоновыйэлектролит поли(бромида N-этил-4-винилпиридиния) позволяет в течение двух минутопределить 11 неорганических анионов, а также катионы некоторых металлов вкомплексах с ЭДТА.Метод «ионная хроматография - капиллярный электрофорез» для определениязаряженных аналитов имеет преимущества по сравнению с ионной хроматографией.Взаимодействие ионообменника с аналитом в КЭ происходит в пределах одной фазы, всвязи с чем не наблюдается уширения пиков, характерное для ионной хроматографии.Крометого,анализметодомКЭболееэкспрессный.Так,стандартнаяэлектрофоретическая методика с использованием ЦТАБ в качестве модификатора64позволяет определить 10 органических кислот в течение 4 мин, что значительно быстрее,чем в случае анализа методом ионной хроматографии [169].Несмотря на то, что работы по применению водорастворимых полиэлектролитныхполимеров в КЭ представленыдостаточно полно, публикации, посвященныеиспользованию наноразмерных твердых анионитов в методах разделения, практическиотсутствуют.
Большая ионообменная емкость наноанионитов, высокая адгезия кповерхностикварцапозволяетрассматриватьихвкачествеперспективныхмодификаторов фонового электролита и стенок кварцевого капилляра для эффективного иселективного разделения анионов методом «ионной хроматографии-капиллярногоэлектрофореза».II.4.5. Системы оценки полярности фаз в газожидкостной хроматографииХроматографические методы могут быть использованы и как методы измеренияфизико-химических величин, поскольку удерживание веществ на колонках подчиняетсяосновным термодинамическим закономерностям [193]. Время удерживания в ГЖХзависит как от природы стационарной фазы, так и свойств определяемого аналита.Основные межмолекулярные взаимодействия между аналитами и стационарной фазойподразделяютнадисперсионные,электростатические,индукционные,донорно-акцепторные, ориентационные и ион-дипольные.Для характеристики полярности стационарных фаз и количественной оценкивкладов различных взаимодействий н.ф.
с аналитами различной природы предложенонесколько подходов. Индексы удерживания Ковача определяются при постояннойтемпературе и характеризуют удерживание вещества относительно удерживания налканов[194].Исправленныеобъемыудерживаниян-алкановувеличиваютсяэкспоненциально с ростом числа атомов углерода (20).log V’ = An+B,(20)где V’ – исправленный объем удерживания, n – число атомов углерода, А и В –коэффициенты, зависящие от температуры и типа стационарной фазы.Таким образом, индекс удерживания Ковача определенного соединения (х) наданной стационарной фазе равен числу атомов углерода гипотетического н-алкана,имеющего такой же объем удерживания, как и вещество (х) при заданных условияхэксперимента, умноженному на 100 (21):(21)при условии, что65,где–исправленные временаудерживания линейныхуглеводородов с числом углеродных атомов z, z+n и соединения i.Коэффициент А в уравнении (20) связан со свободной энергией растворенияметиленовой группы в исследуемой жидкой стационарной фазе.
Роршнайдер показал, чтовозможно предсказывать инкремент удерживания ∆I для конкретного соединения, анализкоторого проведен сначала на неполярной, а затем на полярной фазе (22) [195].∆I = aX + bY + cZ + dU + eS(22)Коэффициенты a, b, c, d, e характеризуют природу определяемого соединения, аX, Y, Z, U и S – полярную стационарную фазу относительно неполярной - сквалана. Вкачестве же пяти референсных соединений, для которых все коэффициенты a-e равнынулю, кроме одного, характеризующего определенный тип взаимодействий, быливыбраны бензол (а = 1), этанол (b=1), метилэтилкетон (c=1), нитрометан (d=1) и пиридин(e = 1).
Таким образом, стало возможно определять значения констант Роршнайдера (X-S)любой стационарной фазы просто сравнивая индексы удерживания Ковача реперныхсоединений, полученные на данной стационарной фазе и сквалане. Позже Мак-Рейнольдс[196] предложил использовать 10 реперных соединений, пять первых из которых схожипредложенным Роршнайдером: бензол (а=1), н-бутанол (b=1), 2-пентанон (с = 1),нитропропан (d=1), и пиридин (е = 1). Этот набор соединений сейчас широко принят дляхарактеристики полярности стационарных фаз на основе X, Y, Z, U и S константРоршнайдера – Мак-Рейнольдса. Для того чтобы иметь полное представление о характереудерживания компонентов на исследуемой стационарной фазе необходимо получитьзначения всех констант, однако, иногда обходятся лишь значением суммы пяти констант.Это значение и характеризует полярность фазы.
Типы межмолекулярных взаимодействий,проявляемые стационарной фазой для каждого из пяти реперных соединений, описываюткак следующие: Х (бензол) – π-π взаимодействия, Y (н-бутанол) – способность кобразованию водородных связей, Z (2-пентанон) - поляризуемость и дипольный характерстационарной фазы, U (нитропропан) – электрон-донорные, электрон-акцепторные идиполярные взаимодействия, S (пиридин) -кислотно-основные взаимодействия [197,198].Существуют и другие подходы к оценке полярности стационарных фаз в ГХ.Например, в [199] предложен новый метод, который не требует проведенияэкспериментов по специальным веществам, как в случае расчет констант Роршнайдера и66Мак-Рейнольдса, а оценка происходит по параметрам удерживания произвольныхмолекул, для которых необходимо знать только индекс Ковача, дипольный моментмолекулы и обобщенный заряд.II.4.6.
Электрофоретические методы определения белковРазделение и определение белков в биологических матрицах является сложнойаналитическойзадачей.Традиционноэлектрофорезвполиакриламидномгеле,изоэлектрическое фокусирование и двумерный гель-электрофорез являлись основнымиметодами анализа белковых смесей [187,200]. В настоящий момент доминирующимиметодами являются ВЭЖХ и УВЭЖХ с МС детектированием [201,202]. Однако метод КЭ,активно используемыйприанализе белковых смесей, имеет ряд достоинств посравнению с другими[203]. Основная проблема при электрофоретическом разделениибелков - взаимодействие со стенками капилляра, приводящее к невоспроизводимостипараметров миграции, низкому разрешению и эффективности [204].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
