Диссертация (1150303), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Эта проблема можетбыть решена проведением анализа в сильно кислотных или щелочных буферах. Однакодля обеспечения стабильности белков в процессе анализа зачастую необходимоиспользование физиологических условий: рН среды должен быть близок к 7. Наиболееоправданным подходом для решения проблемы сорбции белков является модификацияповерхности кварцевого капилляра [205-211]. Пример такого подхода предложен в [209],где полимерная ионная жидкость использовалась в качестве динамического покрытиякапилляра для электрофоретического разделения модельной смеси четырех белков.
Этопокрытие генерировало обращенный ЭОП и препятствовало сорбции белков на стенкахкапилляра. Значения эффективности при определении белков варьировались в диапазоне200000 – 500000 т.т/м.II.4.7.Электрофоретические методы определения катехоламиновНейтротрасмиттеры(нейромедиаторы)-биологическиактивныевещества,являющиеся посредниками в передаче электрического импульса между нейронами, атакже от нейронов к мышечной ткани.
Катехоламины - адреналин (эпинефрин),норадреналин (норэпинефрин), допамин и их метаболиты (метанефрин, норметанефрин)(рис.4.6.) - важнейшие нейротрансмиттеры, участвующие в обменных и энергетическихпроцессах. При расстройствах функций мозга и заболеваниях центральной нервнойсистемысодержаниезначительнокатехоламиновувеличиваетсявкрови,[212,213].моче,Вовлечениеспинномозговойжидкостинейтротрансмиттероввомножественные регуляторные и метаболические процессы обуславливает важность прииспользовании их в качестве диагностических биомаркеров. Например, шизофрения и67болезнь Паркинсона сопряжены с недостатком допамина, в то время как пациентыстрадающиеотопухолейнервнойткани(феохромоцитомы,параганглиомыинейробластомы) и надпочечников имеют аномально высокое содержание катехоламинов вплазме крови и моче [214-216].АдреналинНорадреналинМетанефринДопаминНорметанефринРис.
4.6. Структурные формулы катехоламинов.Близкие химические структуры катехоламинов и их метаболитов, а также ихнизкое содержание в биологических объектах (в моче - мкг/сут,а в плазме крови – пг/мл)требуют применения высокочувствительных и селективных методов. Среди раннихметодов – радиоферментный и иммунологический. Позднее для этой цели былвостребован метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии(ОФ ВЭЖХ) [217].КЭтакжеширокоиспользуетсяприанализесмесейкатехоламиноввбиологических жидкостях [218]. Однако как и в случае белков, из-за наличия аминогрупп в структуре катехоламинов, способных протонироваться, их электрофоретическоеразделение сопровождается взаимодействием с отрицательно заряженными стенкамикапилляра.
Кроме того, неустойчивость катехоламинов в щелочной среде ограничиваетиспользование буферных электролитов с рН> 7. В качестве модифицирующих агентовиспользуют метилметакрилаты с амино- и аммонийными группами, поливиниловыеспирты, метилцеллюлоза, полиакриламиды, циклодекстрины, фуллерены и т.д. Болееподробно эта информация была рассмотрена в разделе II.4.2.II.4.8. Методы разделения энантиомеров β-блокаторовβ-Адреноблокаторы – лекарственные препараты, действующие как блокаторы βадренергических рецепторов. Существуют два структурных классаарилэтаноламины и арилоксипропаноламины (Табл.
4.1.).68β-блокаторов:Таблица4.1.Структурныеформулыβ-блокаторов:арилэтаноламиновиарилоксипропаноламинов.АрилэтаноламиныЭфедринАдреналинЛабеталолАрилгидроксипропаноламиныПропранололКарведилолСоталолМолекулы арилгидроксипропаноламинов имеют по одному хиральному, а значит,два стерических изомера, биологическая активность которых существенно отличается.Например, (S)-пропранолол является важным лекарством против окислительного стресса,проявляющим β-блокирующую эффективность в 40 раз сильнее по сравнению с (R)энантиомером.
(R)-пропранолол менее активно связывается с белками плазмы, чем Sизомер. Карведилол – блокатор β1,2-и α1-адренорецепторов, благодаря чему он снижаетартериальное давление. Блокирование α1-адренорецепторов осуществляется обоимиэнантиомерами карведилола, однако блокирование β-адренорецепторов происходиттолько за счет S-формы [219]. Несмотря на то, что фактически вся основнаятерапевтическая активность заключается в (S)-изомере β-блокаторов, в большинствелекарственных препаратов они находятся в виде рацемической смеси. Таким образом,развитие методов препаративного разделения энантиомеров и контроля энантиомернойчистоты является крайней важной областью исследований.Метод ВЭТСХ имеет преимущества среди других в плане простоты проведенияпроцедуры разделения, дешевизны оборудования, а также возможностей препаративногоразделения аналитов.
В [220] обобщены методы ТСХ разделения энантиомеров βблокаторов. В [221] сообщаетсяоб использовании хирального селектораN-бензоксикарбонилглицил-L-пролина в составе элюента (дихлорметана) для разделенияэнантиомеров альпренолола и пропранолола. Оправдавшим себя приемом при хиральномразделении β-блокаторов явилось использование принципа лигандного обмена [222],основанного на образовании диастериомерных ассоциатов между разделяемымианалитами и комплексами ионов Cu(II) c аминокислотой с определенной конфигурацией69хирального центра ( L-пролин, L-аргинин и т.д.). При этом возможны варианты введенияхирального селектора как в состав подвижной, так и стационарной фаз.
Эффективнымоказалось использование ТСХ-пластин, модифицированных аминокислотой и ионамимеди(II) в подвижной фазе, например, при разделении энантиомеров атеналола,пропранолола и сальбутамола;стационарная фаза – силикагель, модифицированныйраствором N,N-диметил-L-фенилаланина, п.ф. - MeCN–MeOH–водн.Cu(II),2 mM (3:4:5)[223] (рис.4.7.).Рис.4.7. Фотография ТСХ-пластины, демонстрирующая разделение рацемической смесиатенолола, пропранолола и сальбутамола на пластине, модифицированной N,N-диметил-Lфенилаланином.
П.ф.: MeCN–MeOH–водн., Cu(II) 2 mM (3:4:5), 1. (S)и(R) изомеры атенолола, 2.(S)-атенолол; 3. (S) и (R) изомеры пропранолола, 4. (S)-пропранолол; 5. (S) и (R) изомерысальбутамола [223].II.4.9. Хроматографические и электрофоретические методы определениякортикостероидовКортикостероиды относятсяк подклассу стероидных гормонов, производимыхкорой надпочечников и обладающих глюкокортикоидной и минералкортикоиднойактивностью.Глюкокортикоиды(например,кортизол,кортизон)-стероидныепротивовоспалительными средствами, основными показаниями к применению которыхявляются ревматизм, ревматоидный артрит, бронхиальная астма, нейродермит и др.Содержание кортикостероидов в плазме крови и моче - важный диагностический маркердисфункции гипофиза и надпочечников [224].На более ранних этапах для определения кортикостероидов использовался восновном иммуноферментный метод.
Позднее - ВЭЖХ с УФ, флуоресцентным, массспектрометрическим детектированием, а также ГЖХ [225-230]. В КЭ кортикостероиды,70являясь нейтральными аналитами, могут быть разделены только в режиме МЭКХ сиспользованиемПАВвконцентрации,большейкритическойконцентрациимицеллообразования (ККМ).
Одна из первых работ по разделению кортикостероидов врежиме МЭКХ появилась еще в 1990 г., где смесь из 12 кортикостероидов удалосьразделить с использованием холата натрия в качестве мицеллообразующего агента [96231], а позднее - ДДСН [232]. Для увеличения селективности разделения в фоновыйэлектролит вводят комплексообразующие добавки, например, ЦД и его производные. Так,в [233] отмечено влияние концентрации и типа ЦД на селективность разделения гормоновв условиях микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) (рис.4.8.).Рис.4.8. Влияние природы циклодекстрина (5 мМ) на разделение тестовой смеси стероидовв условиях МЭЭКХ.
Условия: 1,36% н-гептана, 6,6% н-бутанола, 4% натриевой солитауродезоксихолиновой кислоты, 50мМ фосфатный буферный раствор рН 2,5, (А) – βциклодекстрин, (В) гидроксипропил-β-циклодекстрин, (С) диметил-β-циклодекстрин, (D)гептакис(2,3,6 – три-О-метил)-β-цилкодекстрин [233].Для варьирования селективности разделения гормонов в МЭКХ возможноиспользование смешанных мицелл [234-237], а также полимерных модификаторов,имеющих мицеллоподобную структуру. В [238] изучен эффект совместного присутствиямицелл ДДСН и поли(N-изопропилакриламида) в качестве псевдостационарных фаз, чтообеспечилоселективноеразделениепятистероидныхгормонов:тестостерона,гидрокортизон-21-ацетата, дексаметазона, преднизолона и гидрокортизона.
Улучшениеселективностиразделенияобъяснялосьраспределениемстероидовмежду двумяпсевдостационарными фазами: мицеллами ДДСН и ассоциатами полимера с молекуламиДДСН. Другой пример использования полимерных модификаторов описан в [239], гденовыйамфипатическийблок-сополимернаосновеполи(трет-бутилакрилата)иполи(глицидилметакрилата) был использован в качестве покрытия стенок кварцевогокапилляра. Выполняя функцию стационарной фазы, он обеспечил разделение стероидныхгормонов с высокой эффективностью и селективностью разделения.71III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬIII.1. АппаратураАппаратурное оформление включало:Видеоденситометр«Sorbfil-денситометр»(г.Краснодар,ОООИМИД).Осветительная камера: лампа люминисцентная ультрафиолетовая КЛЧ 9/УФ 365 нм илампа ртутная бактерицидная ДКБ 9 254 нм.Газовый хроматограф Perkin-Elmer Clarus 500 с детектором по теплопроводности иПИД. ЯМР-спектрометр «Bruker Spectrospin» AM-500. Система капиллярного электрофореза «Капель-105М» со спектрофотометрическимдетектором (НПО «Люмэкс», г.Санкт-Петербург) (рис.1.1.).
Источник света дейтериевая лампа. Диспергирующий элемент - дифракционный монохроматор соспектральным диапазоном работы 190-380 нм и шириной спектрального интервала 20нм.Охлаждение капилляра – жидкостное с заданием и контролем температурытеплоносителя (диапазон от -10оС до +30оС).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
