Диссертация (1150303), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Предварительнокапиллярпромывалифоновымэлектролитом,несодержащимполимерныхмодификаторов. Стабильность формируемого покрытия контролировалась по величинеЭОП и стабильности времен миграции катехоламинов.Электрофоретический анализ смеси белковЭлектрофоретическое разделение белков проводилось в 100 мМ фосфатномбуферном растворе (УФ детектирование (214 нм), гидродинамический ввод пробы 2 с 30мбар) непосредственно после модифицирования капилляра СРП и предварительной егопромывки фоновым электролитом, не содержащем полимерных модификаторов.Найденные условия создания физически-адсорбированных покрытий стеноккапилляра СРП с последующим анализом на них смесейкатехоламинов и белковобобщены в табл.
10.1.Таблица 10.1. Электрофоретические условия формирования физически-адсорбированныхпокрытий стенок кварцевого капилляра СРП и их комплексами с ионами Cu(II) для разделениякатехоламинов и белковpH7 (20 мМфосфатныйбуферныйраствор)4 (50 мМацетатныйбуферныйраствор)Условия модификацииМодификаторВремямодификации, (мин.)PEI-Mal-A30(50 мг/мл)PEI-Mal-B(50 мг/мл)PEI-Mal-С(50 мг/мл)PEI-Mal-A30(50 мг/мл)PEI-Mal-B( 50 мг/мл)PEI-Mal-B(50 мг/мл)91Промывка капиллярапосле модификации10 мин водой и 30минсоответствующимфоновымэлектролитом10 мин водой и 30минсоответствующимфоновымэлектролитомАнализУсловияКатехоламины (50мМ ацетатныйбуферный раствор).Белки (100 мМфосфатныйбуферный раствор)Катехоламины (50мМ ацетатныйбуферный раствор).Белки (100 мМфосфатныйбуферный раствор)12 (5 мМ NaOH)+2Cu -PEI-Mal-A5кДа (6:1, мольн.)+2Cu -PEI-Mal-B5kDa (4:1, мольн.)+2Cu -PEI-Mal-C5kDa (3:1 мольн.)10 мин водой и 30минсоответствующимфоновымэлектролитом30Катехоламины (50мМ ацетатныйбуферный раствор),Белки (100 мМфосфатныйбуферный раствор)III.10.3.On-line концентрирование катехоламинов на модифицированныхкапиллярахСтэкинг с усилением поляКатехоламины, растворенные в 1 мМ растворе HCl и разбавленные водой до 25мкг/мл, вводились в капилляр, заполненный 50 мМ ацетатным буферным растворомгидродинамически (2, 10, 15с × 30 мбар).
Анализ проводился в условиях нормальнойполярности (ввод пробы с анодного конца) на капиллярах, модифицированных СРП PEIMal-А и С (5 кДа).Стэкинг с усилением поля с водной пробкойВкапилляр,заполненный50мМацетатнымбуфернымраствором,гидродинамически последовательно вводили воду («водная пробка») и растворкатехоламинов в 1 мМ растворе HClи разбавленный до 25, 2,5 и 0,25 мкг/млдистиллированной водой. Ввод пробы катехоламинов гидродинамический, 2 с ×30 мбар;время ввода водной пробки варьировалось (30 мбар × 5, 30, 60, 90, 100, 110 с).
Анализпроводился в условиях нормальной полярности на капиллярах, модифицированных СРПPEI-Mal-А и С (5 кДа).Стэкинг с большим объемом вводимой пробыКатехоламины, растворенные в 1 мМ раствора HCl и разбавленные водой до 25, 2,5и 0,25 мкг/мл, вводились в капилляр, заполненный 50 мМ ацетатным буферным растворомгидродинамически (30 мбар × 100, 150, 200, 250 и 300 с). Анализ проводился в условияхнормальнойполярностинакапилляре,модифицированномсверхразветвленнымполимером PEI-Mal - С (5 кДа).III.10.4.On-line концентрирование белков на модифицированныхкапиллярахСтэкинг с усилением поляБелки, растворенные в воде, в концентрации 1 мг/мл вводились гидродинамически(2с 30 мбар, 2с 60 мбар) в капилляр, заполненный 50 мМ ацетатным буферным растворомАнализ проводился при нормальной полярности на капиллярах, модифицированныхсверхразветвленными полимерами PEI-Mal - А и С (5 кДа).92Стэкинг с усилением поля с водной пробкойВкапилляр,заполненный50мМацетатнымбуфернымраствором,гидродинамически последовательно вводили воду («водная пробка») и раствор белков (1мг/мл) в дистиллированной воде (2 с ×30 мбар); время ввода водной пробкиварьировалось (30 мбар × 10, 30, 60, 90, 100 и 110 с).
Анализ проводился в условияхнормальной полярности на капиллярах, модифицированных СРП PEI-Mal -А и С (5 кДа).Стэкинг с большим объемом вводимой пробыБелки, растворенные в воде и разбавленные до100, 10 и 1 мкг/мл,гидродинамически (30 мбар 20, 40, 60 с) вводились в капилляр, заполненный 50 мМацетатным буферным раствором, Анализ проводился в условиях нормальной полярностина капилляре, модифицированном сверхразветвленным полимером PEI-Mal - С (5 кДа).III.11. Разделение энантиомеров аминокислот в условияхкапиллярного электрофореза с использованием СРП в качествехиральных селекторовЭксперименты по хиральному разделению триптофана и тирозина проводились в15 мМ боратном буферном растворе (рН = 12.0; 11.0; 10.0), 50 мМ ацетатном буферномрастворе(pH = 4.0) и 5 мМ растворе гидроксида натрия (pH = 12).
Варьироваласьконцентрация полимера и природа олигосахаридной оболочки (Lac, Mal).Испытаны следующие составы фонового электролита:o 5, 10,50 мг/мл PEI-Lac-A, PEI-Mal-A в 5 мМ растворе NaOH рН 12;o 5, 10, 50 мг/мл PEI-Lac-A, PEI-Mal-A в 15 мМ боратном буферном растворерН 10, 12;o 5, 10, 50 мг/мл PEI-Lac-A, PEI-Mal-A в 50 мМ ацетатном буферном растворерН 4;+2o Cu -PEI-Mal-А, В и С (20:1, 6:1, 4:1, 1:1, мольн.) в 15 мМ боратномбуферном растворе рН 10;+2o L-Tyr -Cu – СРП+2и L- Pro - Cu –СРП комплексы в 15 мМ боратномбуферном растворе, рН 10 (соотношения компонентов в комплексах: PEIMal-A (3:3:1, мольн.), PEI-Mal-A (4:4:1, мольн), PEI-Mal-A (6:6:1, мольн.).93III.12. Разделение энантиомеров β-блокаторов методомвысокоэффективной тонкослойной хроматографии сиспользованием СПР в качестве хиральных селекторовIII.
12.1. Модификация стационарной фазы сверхразветвленнымиполимерамиМодификация пластин осуществлялась опрыскиванием их водными растворамиполимеров. PEI-Lac-A, B, C 5kDa (0,4 -3,6 мг/мл); PEI-Mal-A, В, C 5kDa (0,4 –3,6 мг/мл); PEI-Mal-B Rh 5kDa (0,4 -1,2мг/мл); PEI-Lac-A 5kDa (0,4 -1,2мг/мл) + CuSO4 ∙5H2O (2мМ);Навески полимеров растворяли в 5 мл дистиллированной воды; по 2,5 мл растворапомещали в пульверизатор и опрыскивали каждую ТСХ пластинку, после чего сушили нанагревательном столике при температуре 35-40 ⁰С в течение часа.III.12.2. Модификация подвижной фазы сверхразветвленнымиполимерамиМодификация подвижной фазы осуществлялась растворением навески хиральногоселектора (сверхразветлвенные полимеры PEI-Mal, Lac-А, B, С 5 кДa 0,5 – 2,0 мг/мл и Lпролина 1,7%(масс.,) и 3,4%(масс.,) массовая доля от ПФ) в дистиллированной воде споследующимсмешиваниемсостальнымикомпонентамиподвижнойфазывопределенных соотношениях.Проявление хроматограмм проводилось при комнатной температуре 20±5°С вусловиях восходящей ТСХ: после первого элюирования пластина высушивалась в течение40 мин при 35°С, а затем переворачивалась на 90⁰С и проводилось повторноеэлюированиевтойжеподвижнойфазе.ДетектированиеУФ(254нм,видеоденситометрическое).III.
12. 3. Оптимизация условий разделения энантиомеров β-блокаторовПриразделенииэнантиомеровβ-блокаторовкарведилола) проводилось модифицирование(пропранолола,соталолаинеподвижной фазы и одновременноподвижной и неподвижной фаз с использованием следующих хиральных селекторов: PEILac-A, B и C 5кДa, PEI-Mal-A, B и С 5кДa и L-пролин (табл. 12.1 – 12.3).94Таблица 12.1. Состав испытанных подвижных фаз и концентрации хиральных селекторовпри поиске условий хирального разделения пропранолола.Подвижная фазаХиральный селекторв НФ (мг/мл)MeCN:MeOH (7:3, объемн.)Способ проявленияPEI-Lac-A 5кДa(0,4-3,6)PEI-Mal-A 5кДa(0,4-3,6)PEI-Lac-B 5кДa(0,4-3,6)Одно-, двукратноеPEI-Mal-B 5кДa(0,4-1,2)PEI-Lac-C 5кДa(0,4-3,6)Одно-, двукратноеPEI-Mal-C 5кДa(1,2-2,8)Одно-, двукратноеОдно-, двукратноеОдно-, двукратноеОдно-, двукратноеТаблица 12.2.
Состав испытанных подвижных фаз и концентраций хиральныхселекторов при определении энантиомерного состава соталола.Подвижная фазаMeCN:MeOH (7:1.5,объемн.)Хиральный селектор в НФ (мг/мл)Способ проявленияPEI-Lac-A, В, С 5кДа (1,2 – 2 мг/мл)PEI-Mal-A, В, С 5кДа (1,2 – 2 мг/мл)Одно-, двукратноеТаблица 12.3. Состав испытанных подвижных фаз и концентраций хиральных селекторовпри оптимизации условий хирального разделения энантиомеров карведилолаПодвижная фазаMeOH:MeCN(3:7, объемн.,)EtOH:MeCN (7:3,объемн.,)Состав хроматографическойсистемыСпособпроявлениян.ф.: PEI-Lac-С 5кДa – 0, 10, 14, 18мг/млДвукратноен.ф.: PEI-Lac-A 5кДa – 0, 2, 6 мг/мл+ CuSO4 ∙ 5H2O (2мМ)Одно-, двукратноен.ф.: PEI-Lac-A 5кДa – 0, 2, 6 мг/мл+ CuSO4 ∙ 5H2O (2мМ)Одно-, двукратноеп.ф.
+ L-Pro (1.7% масс.)н.ф.: PEI-Lac-A 5кДa (10мг/мл)Одно-, двукратное95п.ф. + L-Pro (3.4% масс.)н.ф.: PEI-Lac-A 5kDa (10мг/мл)Одно-, двукратноеп.ф. + L-Pro (1.7% масс.)Одно-, двукратноеп.ф. + L-Pro (1.7% масс.)н.ф. PEI-Lac-C 5kDa (10мг/мл)н.ф. PEI-Mal-C 5kDa (10мг/мл)Одно-, двукратноеОдно-, двукратноеIII.13. Электрофоретическое разделение неорганических анионов иорганических кислот с модификацией фонового электролитананоанионитомIII.13.1.Приготовлениефоновыхэлектролитовдляэлектрофоретическогоразделениянеорганическиханионовиорганических кислотДля электрофоретическогоразделения неорганических анионов в работе былииспытаны следующие составы фоновых электролитов:1.20 мМ ДЭА, 5 мМ CrO42-, 1,65 мМ ЦТАБ,2.10, 20, 40 мМ ДЭА, 5 мМ CrO42-, 0,015; 0,025; 0,05; 0,1; 0,2 НИА,3.40 мМ ДЭА, 5 мМ CrO42-, 0,05 мМ НИА, 5, 10 и 15%(объемных) метанолаили ацетонитрила,4.10 мМ бензойная кислота, 9 мМ ДЭА, 0,5 мМ ЦТАБ,5.10 мМ бензойная кислота, 9 мМ ДЭА, 0,05; 0,025; 0,01; 0,005 мМ НИА,6.10 мМ бензойная кислота, 9 мМ ДЭА.Фоновый электролит 1 готовили последовательным смешением 750 мкл 20 мМраствора CrO42-, 300 мкл 200 мМ раствора ДЭА, 1500 мкл 3,3 мМ раствора ЦТАБ, идоведением объема полученной смеси до 3 мл деионизованной водой.Фоновый электролит 2 готовили последовательным смешением в эппендорфах10 мМ раствора CrO42- (500 мкл), 200 мМ раствора ДЭА (100, 200 и 400 мкл), 0,43мМ раствора НИА (232, 116, 58 и 35 мкл) с доведением общего объема полученной смесидо 1 мл деионизованной водой.
Конечная концентрация НИА в фоновом электролитесоставляла 0,1, 0,05, 0,025, 0,015 и 0,01 мМ, соответственно. Для получения фоновыхэлектролитов с концентрацией НИА 0,2 мМ последовательно смешивали 10 мМ растворCrO42- (500 мкл), 200 мМ раствор ДЭА (100 мкл), 4.3 мМ раствор НИА (47 мкл) сдоведением общего объема полученной смеси до 1 мл деионизованной водой.96Фоновый электролит 3 готовили последовательным смешением в эппендорфах 20мМ раствора CrO42- (250 мкл), 200 мМ раствора ДЭА (100 мкл), 0.43 мМ раствора НИА(500 мкл), метанола (50, 100 и 150 мкл), или ацетонитрила (100 мкл) и с доведениемобщего объема полученной смеси до 1 мл деионизованной водой.Для электрофоретическогоразделения органических кислот в работе былииспытаны следующие составы фоновых электролитов:5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
