Диссертация (1150303), страница 20
Текст из файла (страница 20)
PEI-OSсинтезированы научной группой Дрезденовского Технического университета им.Лейбница.Рис. 2.2. Схема синтеза олигосахаридных производных (PEI-OS) и механизм реакции[62].PEI-OS имеют мицеллоподобную структуру, большое количество терминальныхгрупп и хиральных центров в оболочке. Как и в случае наноанионита, первоначальнонеобходимо было выяснить способность PEI-OS модифицировать стенки кварцевогокапилляра. При этом предполагалось, что взаимодействие с силанольными гидроксиламиповерхности капилляра будет происходить преимущественно за счет амино- группполиэтилениминового ядра, а олигосахаридная оболочка будет изменять свойствамодифицированнойповерхности.Аналогичные116примерыиспользованиябифункциональных материалов описаны и в литературе [183]. В то же время наличиемножества функциональных групп и хиральных центров на периферии молекулыпозволяют прогнозировать их использование в качестве хиральных селекторов.Обсуждению этих аспектов применения PEI-OS посвящена данная глава.IV.2.1.
PEI-OS - модификаторы кварцевого капилляра в КЭОсновной проблемой в КЭ при решении различных медико-биологических задачявляется необратимая сорбция основных аналитов (белков, пептидов, нейромедиаторов)на внутренней поверхности кварцевого капилляра за счетэлектростатическоговзаимодействия заряженных функциональных групп аналитов с противоположнозаряженными группами сорбента, что приводит к невоспроизводимости времен миграциии снижению эффективности.Уникальная структура СРП и наличие большого числа функциональных группмогли бы обеспечить эффективное покрытие стенок капилляра и стабильный ЭОП.
Взависимости от рН изучаемые СРП могут приобретать различный заряд за счетпротонированияамино-группполиэтилениминовогоядралибодепротонированиягидроксильных групп на поверхности олигосахаридной оболочки полимера. Исходя изэтого для создания покрытия необходимо было подобрать соответствующее значение pHрабочего электролита. Не исключена возможность совместного использования PEI-OS ссоединениями, имеющими заряд в водных растворах электролитов (соли переходныхметаллов Cu(II), Zn(II), ионные жидкости и т.д.).
С одной стороны, они могутвзаимодействовать с отрицательно заряженными стенками капилляра, а с другой - cотрицательно заряженными полимерными модификаторами, что может способствоватьформированию полимерного покрытия, препятствующего сорбции основных аналитов.При изучении PEI-OS как модификаторов стенок капилляра в качествегидрофильных аналитов для электрофоретических экспериментов выбраны катехоламины(допамин, эпинефрин,норметанефрин, норэпинефрин) и белки (лизин, альбумин,миоглобин, трансферрин).Высказаны предположения относительно возможных вариантов формированияпокрытия капилляра с участием СРП: Непосредственноевзаимодействиеполимерассиланольнымигидроксильными группами внутренней поверхности капилляра. Модифицированиекапилляракомплексами“Сu2+-СРП”засчетвзаимодействия ионов меди с силанольными гидроксильными группами.Это предстояло проверить.117IV.2.1.1.
Электрофоретическое разделение катехоламинов и белков на капиллярах,модифицированных СРППервоначально для создания полимерного покрытия капилляр кондиционировалирастворами полимеров PEI-Mal структуры A, B и C в 30 мМ фосфатном буферномрастворе (рН 7), при котором полимеры имеют заряд, противоположный заряду стеноккапилляра (см. раздел III.10.1.).
Полимер А, содержащий максимальную концентрациюолигосахаридных фрагментов в оболочке, блокирующих доступ к положительнозаряженному полиэтилениминовому ядру, адсорбируетсяна стенках капилляра. Этовызывает снижение ЭОПа в 3-5 раз. При использовании растворов полимеров В и С(промывка капилляра до проведения анализа) ЭОП обращается (табл.2.1.). В структурахэтих полимеров содержание олигосахаридных фрагментов существенно меньше, иполиэтилениминовое ядро доступнее. Протонирование его аминогрупп явилось причинойположительногозарядаповерхностикапилляра.Послемодификациикапиллярпоследовательно промывали 20 мин водой, чтобы удалить избыток полимера изкапилляра, а затем фоновым электролитом, в котором проводился анализ.
создаваемогопокрытия контролировалась по воспроизводимости времени миграции катехоламинов(табл. 2.1).Анализсмесейкатехоламиновнамодифицированныхкапилляраххарактеризовался высокими значениями эффективности (до 220 т.т./м). Однако посленескольких анализов эффективность и селективность разделения снижались (до ~ 40-60тыс. т.т./м) (рис.2.3.).Таблица 2.1.
Характеристики создаваемого покрытия стеноквоспроизводимости времени миграции катехоламинов и величине ЭОП.МодификаторPEI-Malструктура A+2Cu -PEI-Mal структура A(6:1, мол.)PEI-Malструктура B+2Cu -PEI-Mal структура B(4:1, мол.)PEI-Malструктура C+2Cu -PEI-Mal структура C(3:1, мол.)µЭОП,см2/кВ.минСКО временмиграцииКоличествокатехоламинов ванализовусловияхвоспроизводимости,(%)553.005,12501.00-3,673.20-3,51501.15-4,3122.50-4.2601.50118капиллярапоРис. 2.3.
Электрофореграмма смеси катехоламинов, полученная с использованиемкапилляра, модифицированного PEI-Mal-A. (А) сразу после модификации; (Б) через 4 анализапосле модификации. Система КЭ «КАПЕЛЬ-105М»; условия: УФ-детектирование (254 нм); 20кВ;ввод пробы гидродинамический 2с 30 мбар; фоновый электролит 50 мМ ацетатный буферныйраствор (рН = 4).Таким образом, создаваемое покрытие за счет непосредственного взаимодействияположительно заряженного полимера (рН<8) с силанольными гидроксильными группамиоказалось нестабильным и быстро смывалось при промывке капилляра водой илифоновым электролитом, что подтверждается данными по воспроизводимости временмиграции катехоламинов (Табл.2.1.).Для формирования стабильного покрытия предложено использовать в качестве«посредника», связывающего как силанольные гидроксилы поверхности капилляра, так идиольные фрагменты оболочки полимера, ионы меди(II).
На возможное образованиекомплекса «медь-полимер» указывали и полученные нами данные спектрального анализа:появление новых полос поглощения на УФ спектре полимеров PEI-Mal структур A, B, C вприсутствии ионов меди на λ=311, 280, 274 нм, соответственно (рис. 2.4, 2.5, 2.6 а, б).а)б)Рис. 2.4. УФ-спектр (а) раствора полимера PEI-Mal структура A в 5мМ растворе NaOH; (б)раствора комплекса «Cu+2-PEI-Mal структура А» (6:1, мольн.) в 5мМ растворе NaOH. Прибор:Photo-diode Array detector SPD-M20A, Shimadzu119б)a)mAU4000 0.263/ 1.00203209214mAU0.263/ 1.00350030003000250020002742862922000150010004610200300400500600700nm63322366050068550346447003192951000200300400500600700nmРис.
2.5. УФ-спектр (а) полимера PEI-Mal структура B в 5мМ NaOH, (б) раствора полимераCu+2-PEI-Mal структура В (4:1, мольн.) в 5мМ растворе NaOH. Прибор: Photo-diode Array detectorSPD-M20A, Shimadzu.б)a)mAU3000 0.346/ 1.00206mAU0.330/ 1.00400025003500200030002500150020001000234100050027415002505000750nm6446536564707357467587666466565625815905945000250500750nmРис. 2.6.
УФ-спектр (а) раствора полимера PEI-Mal структура C в 5мМ NaOH, (б) Cu+2PEI-Mal структура С (3:1, мольн.) в 5мМ растворе NaOH. Прибор: Photo-diode Array detector SPDM20A, Shimadzu.Это предположение подтверждено экспериментально созданием стабильногопокрытия путеммодификации капилляра обработкой комплексами “Сu2+- СРП” ( 6:1,4:1, 3:1, мольн. для полимеров А, В и С, соответственно) в 5 мМ растворе NaOH (рН11,7)в течение 30 мин.Такое значение рНнаиболее подходящее для созданияотрицательного заряда полимерного модификатораПосле модификации капилляр промывали водойэлектролитом.Стабильностьсоздаваемоговопроизводимости скорости ЭОП (табл.2.1.).снимкамии стенок кварцевого капилляра.(20 мин), а затем -покрытияфоновымконтролироваласьпоФормирование покрытия подтвержденопоперечного среза капилляра, полученными на сканирующем электронноммикроскопе (HITACHI S3400N) (образование органической пленки на стенках капилляра)(рис. 2.7.).120Organic layerб)a)Рис.
2.7. Фотографии среза капилляров полученных на электронном микроскопеS3400N. (а) немодифицированный кварцевый капилляр, (б) капилляр,модифицированный Cu+2-PEI-Mal-A (6:1, мольн.) в щелочной среде.HITACHIВажным фактором при создании такого покрытия явилось определенное мольноесоотношение между Cu2+ и PEI-Mal. Высказано предположение, чтообразованиеассоциатов ионов Cu(II) с полимерами в щелочной среде происходит преимущественно засчет диольных фрагментов олигосахаридной оболочки полимера. Таким образом,требуемоесоотношение Cu2+:PEI-Mal зависит от содержания олигосахаридныхфрагментов в оболочке полимера. Для полимера А соотношение, позволяющее получатьнаиболее прочное физически-адсорбированное покрытие, оказалось равным 6:1 (Cu2+ :PEI-Mal), а для полимеровВ и С- 4:1 и 3:1, соответственно.
Чем большеолигосахаридных фрагментов в оболочке, тем стабильнее покрытие, чтоследует изданных по воспроизводимости времен миграции катехоламинов на модифицированныхкапиллярах и длительности рабочего состояния капилляра (табл.2.1.). Стабильностьпокрытий, полученных таким образом, оказалась значительно выше по сравнению скапиллярами, модифицированными полимерами в отсутствии ионов меди. При этомзначения величины ЭОП, эффективности и селективности разделения катехоламинов ибелков оказались сопоставимы как при модификации с участием ионов меди, так и в ихотсутствии.Для того чтобы оценить возможности модифицированных ассоциатами “Cu2+ СРП”проведенасерияэлектрофоретическихэкспериментовпоразделениюкатехоламинов (допамин, норэпинефрин, эпинефрин, норметанефрин) и белков (лизоцим,альбумин, миоглобин, трансферрин).Для катехоламинов на капиллярах, модифицированных полимером структуры С,где доступность полиэтилениминового ядра больше, эффективность возрастала до 480тыс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
