Диссертация (1150303), страница 21
Текст из файла (страница 21)
т.т/м, по сравнению с 200 000 для полимера структуры А (рис.2.8.). Аналогичноевлияние отмечено и на факторы разрешения пиков (табл.2.2.).Почему?Формируемый положительный заряд поверхности за счет протонированияаминогрупп полимера С приводит к обращению ЭОП и противонаправленному движению121аналитов, что к тому же, благоприятствует и ихконцентрированию.Однако из-заменьшего содержания олигосахаридных фрагментов в оболочке этого полимератенденция к образованию связей между ионами меди и мальтозными группамиреализуется в меньшей степени, а, значит, необходимо повторное обновление покрытия.Рис.2.8. Сравнение значений эффективности (т.т./м) катехоламинов в отсутствиимодификатора и при использовании полимеров с различным содержанием олигосахаридныхфрагментов в составе комплекса «медь-PEI-Mal» (n=3, P=0,95).Использованиемодифицированныхкапиллярахобеспечилоиувеличениеселективности разделения катехоламинов (табл.2.2.).Таблица 2.2.
Факторы разрешения (Rs) катехоламинов и белков на модифицированных инемодифицированных капиллярах (n=3, P=0,95).RsНемодифицированныйкапиллярCu+2-PEI-Mal-A (6:1, мольн.)Cu+2-PEI-Mal-B (4:1, мольн.)Cu+2-PEI-Mal-C (3:1, мольн.)Катехоламиныбелки2.00±0.01(DA/NE)0.51±0.03(NE/NM)0.72±0.01(NM/E)3.30±0.01(DA/NE)0.71±0.01(NE/NM)1.56±0.01(NM/E)4.00±0.01(DA/NE)1.11±0.01(NE/NM)1.82±0.01(NM/E)4.80±0.01(DA/NE)1.43±0.01(NE/NM)1.91±0.01(NM/E)1.02±0.01(Liz/Alb)1.06±0.02(Alb/Mio)1.00±0.04(Mio/Trf)1.1±0.01(Liz/Alb)1.1±0.01(Alb/Mio)2.8±0.01(Mio/Trf)1.1±0.01(Liz/Alb)1.9±0.01(Alb/Mio)3.0±0.02(Mio/Trf)1.03±0.01(Liz/Alb)1.60±0.01(Alb/Mio)4.20±0.01(Mio/Trf)На модифицированных капиллярах оптимизированы условия on-line концентрированиякатехоламинов: стэкинг с усилением поля с «водной пробкой», и стэкинг с большим122объемом вводимой пробы.
Для первого - варьировалось время ввода «водной пробки» (5100, 110 с.), а время ввода анализируемой пробы составило 2с. Формирование «воднойпробки» создает зону низкой проводимости и сильного электрического тока, облегчаямиграциюиконцентрированиезаряженныханалитовнаграницесфоновымэлектролитом. Найдены условия концентрирования катехоламинов при использованиикапилляра, модифицированного комплексом ионов меди с полимером А (1:4, мольн.): 90с. «водная пробка»; 2 с гидродинамический ввод пробы, разбавленной в три раза (рис.2.9) (см.
приложение 4,5); для полимера С: 60 с «водная пробка» и 2 с гидродинамическийввод пробы (рис. 2.10). Значения эффективности для катехоламинов в последнем случаеоказались равными: NDA= 520 000, NNE = 521 000, NNM = 334 000, NE = 430 800 т.т/м (см.приложение 5).Рис. 2.9. Зависимость значений эффективности от времени ввода «водной пробки» приразделении катехоламинов; капилляр модифицирован Cu2+-PEI-Mal структура A (6:1, мольн.).Фоновый электролит 50 мМ АБР, рН 4.При использовании полимера С, значения эффективности достигаемые приконцентрировании заметно больше, т.к. покрытие капилляра «Cu2+- полимер С»формирует обращенный ЭОП, противонаправленный движению разделяемых соединенийи вносящий отдельный вклад в их концентрирование.Рассчитаныпределыобнаружениякатехоламиновконцентрирования, а также факторы концентрирования (SEFh=123внайденных∙ ∆) (табл.
2.3)условияхРис. 2.10. Зависимость значений эффективности от времени ввода «водной пробки» приразделении катехоламинов; капилляр модифицирован Cu2+-PEI-Mal структура С (3:1, мольн.).Фоновый электролит 50 мМ АБР, рН 4.Таблица 2.3. Условия on-line концентрирования, пределы обнаружения и факторыконцентрирования катехоламинов на модифицированных капиллярахКапилляр«Cu2+-полимер-A(Mal) 5кДа»(6:1,мольн.)«Cu2+-полимер-С(Mal) 5кДа»(3:1,мольн.)СпособконцентрированияАналитыУсловияМатрица пробы - вода,Стэкинг сгидродинамический вводусилением поляпробы (30 мбар, 2 сек.),с воднойгидродинамический вводпробкойводы (30 мбар, 90 сек.)Стэкинг сбольшимобъемомвводимойпробыDANENME1,51,3SEFh1,31,5LOD, мкг/мл3,93,32,94,111,311,0SEFhМатрица пробы - вода,гидродинамический вводпробы (30 мбар, 300 сек.)16,715,8LOD, мкг/мл0.20,20,30,2Формирование покрытия капилляра при электрофоретическом разделении смесибелков проводили аналогично катехоламинам.
Капилляр модифицировали растворамикомплексов «Cu2+-полимер» в щелочной среде, а электрофоретический анализ проводилсяв 100 мМ фосфатном буферном растворе (рН 2). Отмечены высокие значенияэффективности (табл.2.4.) и факторов разрешения (табл.2.2.) (рис.2.11). Полимеры В и С,как и в случае катехоламинов, обеспечивали более высокие значения эффективности, чтообусловлено большей доступностью положительно заряженного ядра по сравнению сполимером А, а также созданием обращенного ЭОП, противоположно направленногомиграции белков.124Таблица2.4.Значенияэффективности(N)нанемодифицированноммодифицированными полимерами капиллярах при разделении белков (P=0,95, n=3).иN, т.т./мLizAlbMioTrf20428±4009533±23512643 ±1256448 ± 919206 000±200034 000±50074 000 ±150036 000 ±500Cu+2-PEI-Mal-B(6:1, мольн.)760 600±300087 000±1500312 000 ± 50080 000 ± 1000Cu+2-PEI-Mal-C(3:1, мольн.)860 000 ±900067 000±3000343 000±800046 500 ± 1000Немодифицированныйкапилляр+2Cu -PEI-Mal-A(6:1, мольн.)Рис.
2.11. Электрофореграмма смеси белков (50 мкг/мл) на модифицированном Cu+2-PEIMal-В (4:1, мольн.) капилляре. Условия: Система КЭ «КАПЕЛЬ-105М»; УФ-детектирование (210нм); 20кВ; ввод пробы гидродинамический 2с 30 мбар; фоновый электролит - 100 мМ фосфатныйбуферный раствор (рН = 2).На модифицированных капиллярах выявлены возможности различных вариантовon-line концентрирования белков: стэкинг с усилением поля с «водной пробкой», стэкингс большим объемом вводимой пробы, электростэкинг (табл.
2.5).Таблица 2.5. Условия on-line концентрирования, пределы обнаружения и факторыконцентрирования белков на модифицированных капиллярах.КапиллярСпособконцентрированияCu2+Стэкинг сполимер Bусилением поля(Mal), 5kDaс водной побкой(4:1, мольн.)Cu2+полимер C(Mal), 5кДa(3:1, мольн.)Стэкинг сбольшимобъемомвводимойпробыАналитыУсловияLisМатрица пробы - вода,гидродинамический вводпробы (30 мбар, 2 с.),гидродинамический вводводы (60с)AlbMyoTransfSEFh1,11,11,10,8LOD, мкг/мл11,630,133,258,9SEFhМатрица пробы – вода,гидродинамический вводпробы (30 мбар, 40 с.)45,239,148,2LOD, мкг/мл0,512534,72,41,81,0При поиске условий концентрирования белков на капилляре, модифицированномкомплексом «Cu2+-PEI-Mal-B», в случае стэкинга с усилением поля с «водной пробкой»варьировалось время ввода «водной пробки» (5-110 с.); время ввода пробы составляло 2с.Лучшие результаты получены при следующих условиях стэкинга с усилением поля и«водной пробкой»: 60с «водная пробка», 2с гидродинамический ввод пробы.На капилляре, модифицированном комплексом «Cu2+-полимер С», наиболеерезультативным оказался стэкинг с большим объемом вводимой пробы.
Такой вариантконцентрирования применим в том случае, когда движение аналитов противоположнонаправлению ЭОП. Варьировались степень разбавления пробы (концентрации 0.001-0.1мг/мл) и время ввода пробы. Значения эффективности всоставили: NLis= 980 300, NAlb=106 000, NMyo=472 110, NTrfусловиях (40 с. 30 мбар)=158 150 т.т/м. Рассчитаныфакторы эффективности концентрирования и пределы обнаружения (табл. 2.5.).Последние - снижены в 3-30 раз по сравнению с результатами на модифицированномкапилляре со стандартным вводом пробы (2с 30 мбар).Весь цикл проведенных исследований позволил перейти к анализу реальныхобъектов: плазма крови (определение альбумина рис.2.12, Табл. 2.6) и образцы слюны(определение лизоцима рис.2.13, Табл. 2.7). Содержание этих аналитов - важныйдиагностический критерий различных патологий.Рис.
2.12. Электрофореграмма альбумина в образце сыворотки крови (разбавление в 100раз). Капилляр, модифицированный Cu2+-полимер С. Условия: Система КЭ «КАПЕЛЬ-105М»;УФ-детектирование (210 нм); 20кВ; ввод пробы гидродинамический 2с; фоновый электролит 100мМ фосфатный буферный раствор (рН = 2). Alb = 50 ± 5 мг/мл (P=0,95, n=3).Таблица 2.6. Результаты определения альбумина в сыворотке крови (P=0,95, n=3).АналитВведено, (мг/мл)Найдено, (мг/мл)Альбумин0,550,3±5,154,7±5,0126Степень извлечения,%99±9%Применение стэкинга с большим объемом вводимой пробы на модифицированномкапилляре обеспечило идентификацию лизоцима, содержание которого в слюне – 1 - 40мкг/мл (эффективность 430 800 т.т/м).
Это значительно ниже минимальных значений,детектируемых классическим КЗЭ.0,80,750,7Liz0,65mAU0,60,550,50,450,40,350,30,250,2891011мин121314Рис.2.13. Электрофореграмма лизоцима в образце слюны (капилляр, модифицированныйCu2+-PEI-Mal-С). Условия: УФ-детектирование (210 нм); 20кВ; ввод пробы гидродинамический 2с;фоновый электролит 100 мМ фосфатный буферный раствор (рН = 2).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
