Диссертация (1150303), страница 22
Текст из файла (страница 22)
Liz = 20±1 мкг/мл. (P=0,95,n=3).Таблица 2.7. Результаты определения лизина в слюне (P=0,95, n=3).АналитВведено, (мкг/мл)Найдено, (мкг/мл)Лизоцим0,520,1±1,124,5±1,0Степень извлечения,%-97±4%IV.2.2. Сверхразветвленные полимеры с терминальными олигосахариднымигруппами - хиральные селекторы в КЭ и ВЭТСХНаличие множества хиральных центров в оболочке полимера и высокая плотностьтерминальных олигосахаридных групп указывает на возможность применения изучаемыхСРП в роли хиральных селекторов при разделении энантиомеров низкомолекулярныхбиологически активных соединений. В качестве модельных систем для проведенияхирального разделения взятыβ-блокаторы (соталол, карведилол, пропранолол) иаминокислоты (D/L-триптофан, D/L-тирозин, D/L-β-фенилаланин)(рис.2.14).β-блокаторыПропранололКарведилол127СоталолАминокислоты:D/L-триптофанD/L-тирозинD/L-β-фенилаланинРис.2.14. Структурные формулы аналитов.IV.2.2.1.
Разделение энантиомеров аминокислот в условиях КЭПри поиске условий хирального разделения с PEI-OS в качестве хиральныхселекторов варьировали концентрацию фонового электролита, pH, концентрацию иструктуру полимера (различные плотность и природа олигосахаридной оболочки).Испытаны различные варианты: ввод хирального селектора в фоновый электролит(боратный буферный раствор: 30 мМ и 15 мМ, pH=9-10; ацетатный буферный раствор:50мМ, pH=4; раствор NaOH: 50мМ и 5мМ, pH=12); режим лигандообменного хиральногоКЭ с участием комплексов «Cu2+-PEI-Mal, Lac» (111:1; 50:1; 20:1; 11:1, 6:1, 4:1 мольн.) итройных комлпексов «L-Pro – Cu+2 – PEI-Mal, Lac» , «L-Tyr-Cu+2 –PEI-Mal, Lac» (3:3:1;4:4:1; 6:6:1; 11:11:1, мольн.), вводимых в фоновый электролит.В щелочной среде при введении в фоновый электролит (15 мМ боратныйбуферный раствор, рН 10) полимера А с лактозной оболочкой (50 мг/мл) наблюдаетсянеполное разделение энантиомеров триптофана (α = 1,03) (рис.
2.15). Добиться большегоразрешения путем варьирования рН, концентрации полимера и фонового электролита неудалось.12Рис. 2.15. Электрофореграмма D/L-триптофана. Хиральный селектор: PEI-Lac-A (50мг/мл). Условия: УФ-детектирование, 218 нм, 20кВ; 5с, 30 мбар; 15 мМ боратный буферныйраствор (рН = 10).128Выявлены возможности и лигандообменного режима в КЭ. В качестве хиральногоселектора выступалкомплекс меди (II) с полимером структуры А с мальтознойоболочкой (рис.
2.16).12Рис. 2.16. Электрофореграмма D/L-триптофана. Хиральный селектор: CuSO4∙H2O (2,5мг/мл) + PEI-Mal структура A (50 мг/мл) (1:20, масс.). Условия: УФ-детектирование, 218 нм;20кВ, 5с., 30 мбар; 15 мМ боратный буферный раствор (рН = 10).Для увеличения факторов энантиоселективности варьировали концентрациюполимера – PEI-Lac-А, (2,5-10 мг/мл), PEI-Mal-A (2,5-10 мг/мл) и мольное соотношениемеди и полимера в комплексе: «Cu+2: полимер» (50:1, 115:1, 6:1, 11:1, мольн.).
Однаколучшего разрешения добиться не удалось.Исходя из этого выдвинута идея использования тройных комплексов “СРП – Cu2+ –L-Pro”, где L-пролин должен был бы замещаться молекулами разделяемых аналитов, авторой лиганд - СРП - обеспечил бы более высокие факторы энантиоселективности.Несмотря на выигрыш в эффективности, разделения энантиомеров β-блокаторов добитьсяв указанных выше условиях так и не удалось.Одна из возможных причин этого, скорее всего, в отсутствии второй фазы дляраспределения и, соответственно, разделения энантиомеров.
Эксперименты в условияхВЭТСХ с модификацией поверхности силикагеля по аналогии с блокировкойсиланольных гидроксилов в капилляре подтвердили правильность нашего предположения.IV.2.2.2. Разделение энантиомеров β-блокаторов методом ВЭТСХПри поиске условий хирального разделения в условиях ТСХ варьировался составэлюирующей системы, структура полимерного селектора (плотность и природаолигосахаридной оболочки) и его концентрация(0,4 - 3,6 мг/мл), способ ввода вхроматографическую систему (в состав стационарной фазы или одновременнаямодификация подвижной истационарной фаз), способ129проявления ТСХпластин(однократное и двукратное (2Rf) с поворотом пластины на 900).
Способность этих СРПмодифицировать поверхность силикагеля и вступать в комплексообразование с аналитамигидрофильной природы (водорастворимые витамины и аминокислоты)нами ранееописана в [250].Важными факторамиоказались природа олигосахаридной оболочки и еёконцентрация. В случае β-блокаторов найдены условия разделения энантиомеров всехисследуемых лекарств. Условия и аналитические характеристики представлены в табл. 2.8[251].Таблица. 2.8.
Условия, значения 2Rf и энантиоселективность при разделении энантиомеровβ-блокаторов (n=3, P=0,95).β-БлокаторПропранололПодвижнаяфазаMeCN:MeOH(7:3, объемн.)СоталолCH3CN:MeOH(7:1,5,объемн.)КарведилолEtOH:MeCN(7:3; объемн.) +L-Pro (3,4 %масс.)гдеМодификаторстационарнойфазы (2мг/мл)SRPEI-Lac-A0,34±0,020,93±0,0326,0PEI-Mal-A0,29±0,010,95±0,0237,0PEI-Lac-A0,22±0,010,79±0,0313,0PEI-Lac-A0,94±0,020,99±0,021,7PEI-Lac-C0,94±0,010,97±0,011,92Rfα2Rf - фактор удерживания при двумерном проявлении;2Rf = 1 - (1 - Rf )2α – коэффициент энантиоселективности.α = [(1/Rf1) − 1]/[(1/Rf2) − 1]На примере пропранолола прослеживается тенденция влияния природы иплотности олигосахаридной оболочки (полимеры А, В, С) на значения факторовэнантиоселективности (табл.2.8.).Установлено, что максимальная энантиоселективность (α = 37) достигается привведении в состав стационарной фазы дендритных полимеров с мальтозной оболочкой смаксимальной замещенностью олигосахаридами (полимер А) (рис.
2.17).Высказанопредположение, что комплексообразование происходит с участием межмолекулярныхводородных связей гидроксильной и амино- групп пропранолола с гидроксильнымигруппами мальтозных и лактозных остатков (рис. 2.18) [246].13040α30MalLac20100ABCРис. 2.17. Зависимость факторов энантиоселективности от концентрации полимеров слактозной и мальтозной оболочками [246].а)b)Рис. 2.18. (а) Схема образования комплекса между S- (-) – пропранололом и мальтозой; (b)схема образования комплекса между S-(-) – пропранололом и лактозой.В условиях одно- и двукратного элюирования при модификации стационарнойфазы полимером с лактозной оболочкой (структура А) разделены энантиомеры соталола(табл.
2.9).Таблица 2.9. Факторы удерживания (2Rf) и энантиоселелективности (α) для энантиомеровсоталола (n=3, P=0,95).Подвижная фазаMeCN:MeOH(7:1,5,объемн.)Хиральный селекторв н.ф.(мг/мл)PEI-Lac-A 5kDa0 мг/мл;1,2 мг/мл;2 мг/мл;2RfИзомер 1 Изомер 20,23±0,020,24±0,010,22±0,030,23±0,020,76±0,030,79±0,04αСпособпроявления0,010,013,1ДвукратноеИнтересно отметить, что достигнутые параметры энантиоселективности соталолаи пропранолола при использовании СРП с олигосахаридными оболочками превышаютсоответствующие значения в 4-5 раз дляβ-циклодекстрина, взятого для сравнения вкачестве хирального селектора (табл. 2.10)131Таблица 2.10.
Сравнение значений факторов энантиоселективности пропранолола исоталола при использовании хиральных селекторов: β-циклодекстрин (β-CD) и PEI-Lac-А .Подвижная фазаХиральныйселекторДМФА:BuOH:MeCO2Et(3:5:5, объемн.)β-CD (1мМ)β-CD (4мМ)PEI-Lac-A5kDa(мг/мл)1,22MeCN:MeOH(7:1,5,объемн.,)αПропранололСоталол2,62,42,92,118,426,010,013,1СпособпроявленияДвукратноеДвукратноеРазделение энантиомеров карведилола удалось достичь лишь при совместномприсутствии двух хиральныхселекторов:СРП - в составе стационарной фазы и L-Pro(3,4%), введенного в элюент (α = 6,4) (Табл.2.11, рис.2.18).
Такой результат не достигалсяс использованием только модифицированной СРП стационарной фазы или только привводе L-пролина с подвижную фазу с проведением анализа на немодифицированномсиликагеле. Одно из предполагаемых объяснений подобного синергетического эффекта появлениеучастиемдополнительных хиральных центров и образование водородных связейL-пролина[251].Подобныепримерысинерегтическогоэффектасприиспользовании одновременно двух хиральных селеткоров имеются и в литературе [248].Таблица2.11.Значениепараметровудерживания(2Rf)ифакторовэнантиоселелективности (α) при хиральном разделении «Акридилола», п.ф.: EtOH:MeCN (7:3,объемн.) (n = 3, P = 0,95)Состав хроматографическойсистемып.ф.
+ L-Pro (1,7% масс.)н.ф.: PEI-Lac-C 5 кДa (2 мг/мл)п.ф. L-Pro (1,7% масс.)н.ф.: PEI-Lac-A 5 кДa (2 мг/мл)2RfαСпособпроявленияSR0,88±0,020,93±0,021,7Двукратное0,87±0,030,99±0,011,9ДвукратноеНайденные условия энантиоселективного разделения β-блокаторов и ибупрофенабыли реализованы при установлении энантиомерного составафармпрепаратов:«Акридилол» и «Анаприлин». Полученное соотношение масс энантиомеров сопоставимо,что и соответствует их содержанию в рацемической смеси (табл. 2.12).132БАРис. 2.18. Денситограммы карведилола, п.ф.: EtOH:MeCN (7:3,объемн.,) + L-Pro (1,7%масс.), н.ф.: PEI-Lac-C 5kDa (10мг/мл); А.-одномерное, Б – двукратное проявление.Видеоденситометр «Sorbfil-денситометр», УФ-детектирование, 254 нм [251].Таблица.
2.12. Условияфармпрепаратов (n=3, P = 0,95).Фармпрепарат«Анаприлин»(действующеевеществопропранолол, 10 мг)«Акридилол»(действующеевещество- карведилол,12,5 мг)проведенияирезультатыколичественногоанализаСостав хроматографическойсистемыαСоставн.ф. PEI-Lac-А (2 мг/мл)п.ф. MeCN:MeOH(7:3, объемн.)28,3S – (4,01 ± 0,15) мг,R – (4,50 ± 0,25) мг1,9Изомер 1 – (5,20 ± 0,18) мг,Изомер 2 – (6,90 ± 0,12) мгн.ф: PEI-Lac-A 5kDa (10мг/мл)п.ф.: EtOH:MeCN (7:3, объемн.) +L-Pro (1,7% масс.)Таким образом, установлено, что СРП с олигосахаридной оболочкой могут выполнятьфункции модификатора кварцевого капилляра, причем наиболее стабильные физическиадсорбированные покрытия формируются при обработке капиллярарастворами2+комплексов «Сu -СРП» в щелочной среде. Показано, что полимеры с меньшимсодержанием олигосахаридных фрагментов в оболочке модифицируют стенки капиллярас обращением ЭОП, что приводит к росту эффективности при электрофоретическомразделении катехоламинов и белков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
