Диссертация (1150109), страница 9
Текст из файла (страница 9)
При более высокихконцентрациях реагента происходило постепенное изменение состава комплексоврутина и уменьшение оптической плотности. Оптическая плотность продукта56реакции достигала максимума при концентрации цетилпиридиния хлорида равной0,1 мМ (Рисунок 16).Рисунок 15. Влияние концентрацииРисунок 16. Влияние концентрацииионов алюминия (III) на оптическуюЦПХплотностьрастворарастворааналитическойнаоптическуюаналитическойплотностьформыформы рутина (C(рутин) – 50 мкМ,рутина (С(рутин) – 50 мкМ, С(AlC(ЦПХ) – 0,1 мМ).(III)) – 1,7 мМ).При оптимизации анализа по ЦИ-схеме было изучено влияние температурына процесс образования аналитической формы рутина в диапазоне от 20 оС до 50оС. Оптическая плотность в указанном диапазоне температур не изменялась.4.3. Оптимизация процесса извлечения флавоноидов из лекарственногорастительного сырьяДля различного сырья (травы зверобоя, цветков ромашки и календулы) былаизучена возможность извлечения флавоноидов в растворы различных ПАВ иэтанола в УЗ-поле.
Было показано, что растворы ПАВ не обеспечиваютэффективного извлечения флавоноидов (эффективность извлечения не превышала50 %) при нагревании в УЗ-поле, в отличие от 70 % раствора этанола.При изучении влияния массы навески были зафиксированы объемэкстрагента – 2 мл и время извлечения в УЗ-ванне (130 Вт, 35 кГц) – 10 мин притемпературе 60 оС.
В картриджи помещали от 0,05 до 0,2 г пробы, картриджиподключали к многоходовому соленоидному крану (5) и помещали в УЗ-ванну (4)57(Рисунок 20). После этого в каждый картридж последовательно подавали по 2 мл70 % этанола (кран 7, d) через краны (5 и 7) с помощью перистальтического насоса(6). Затем в течение 10 мин производили УЗ воздействие при температуре 60 оС напробы в картриджах.Через краны-переключатели (5, 7) с помощью реверсивного насоса (6) в РЕ(8, 9, 10) последовательно подавали по 100 мкл экстрактов, полученных вкартриджах (1, 2, 3), 300 мкл 1,7 мМ AlCl3 (5, f) и 300 мкл 0,1 мМ ЦПХ (7, e).Растворы в РЕ (8, 9, 10) перемешивали потоком воздуха (кран 5, d) в течение 10 ссо скоростью 6 мл/мин и выдерживали 5 мин при температуре 25 оС.Далее растворы аналитических форм из РЕ (8, 9, 10) при переключениикранов-переключателей (5, 7) и реверса насоса (6) последовательно перекачивали вкювету спектрофотометрического детектора (11), измеряли оптическую плотностьрастворов при длине волны 415 нм в условиях остановленного потока в течение 10с и растворы сбрасывали.На заключительном этапе из этой же пробы проводили вторичное извлечениеи определение флавоноидов.
Для проверки полноты извлечения выбранныханалитов также проводили третье извлечение из данной пробы сырья, однакозначение аналитического сигнала значительно не отличалось от значения фоновогосигнала. Полученные экспериментальные результаты дают право утверждать, чтоданные БАВ извлекаются в экстрагент в результате двух последовательныхизвлечений.Подэффективностьюизвлеченияпонимаетсяпроцентноесоотношение найденных содержаний БАВ для каждого из двух последовательныхавтоматизированных извлечений из одной и той же пробы сырья.Наоснованииполученныхрезультатов(Рисунок17),массавсехисследованных проб равная 0,1 г была выбрана для дальнейших экспериментов,т.к.
при данном значении массы достигается наибольшая эффективностьизвлечения флавоноидов. При увеличении массы навески пробы наблюдаетсяуменьшениеэффективностиизвлеченияопределяемыхБАВ,связанноеснедостаточным объемом экстрагента, в случае дальнейшего уменьшения массынаблюдается увеличение СКО.58Рисунок 17. Зависимость эффективности извлечения флавоноидов от массыпробы: A – трава зверобоя; Б – цветки ромашки; В – цветки календулы (объемэкстрагента – 2 мл, время извлечения – 10 мин, температура – 60 оС).При изучении влияния объема экстрагента на полноту извлеченияфлавоноидов из ЛРС масса пробы составляла 0,1 г, а время извлечения в УЗ-ванне– 10 мин.
Объем экстрагента варьировали в пределах от 0,5 до 3 мл.При изучении влияния времени извлечения флавоноидов из проб наэффективностьизвлеченияаналитовнапримеретравызверобоябылизафиксированы масса навески – 0,1 г и объем экстрагента – 2 мл. Времяперемешивания пробы с экстрагентом в картридже потоком газа или поддействием УЗ варьировали в пределах от 3 до 30 мин.Из полученных результатов (Рисунки 18, 19) следует, что объем экстрагентаравный 2 мл и время извлечения флавоноидов в УЗ-поле равное 10 мин притемпературе 60 оС являются оптимальными. При повышении температуры выше 60оС эффективность извлечения остается постоянной.
Извлечение данных природныхБАВ в УЗ-поле дает примущество в значительном сокращении времени анализапри автоматизации методики их определения.59Рисунок18.ЗависимостьэффективностиизвлеченияРисунок19.эффективностиЗависимостьизвлеченияфлавоноидов от объема экстрагента:флавоноидовA – трава зверобоя; Б – цветкиперемешивание воздухом; Б – УЗромашки; В – цветки календулыперемешивание(массавремявоздуха – 6 мл/мин, объем экстрагентаизвлечения – 10 мин, температура –– 2 мл, масса пробы – 0,1 г,60 оС).температура – 60 оС).пробы–0,1г,отвремени:(скоростьА–потока4.4. Методика ЦИ-определения флавоноидов в ЛРС с извлечениеманалитов в УЗ-полеПриведённые в предыдущих разделах данные позволили предложитьследующую методику циклического инжекционного спектрофотометрическогоопределения флавоноидов в ЛРС: траве зверобоя, цветках ромашки и календулы.
Вварианте методики, адаптированной к разработанной схеме ЦИА (Рисунок 20), втри съемных картриджа (1, 2, 3) помещали по 0,1 г измельченной пробы (смесь0,01 г измельченного растительного материала и 1 г КСl). Далее все картриджиподключали к многоходовому соленоидному крану (5) и помещали в УЗ-ванну (4).После этого в каждый картридж последовательно подавали по 2 мл 70 % этанола(кран 7, d) через краны (5 и 7) с помощью перистальтического насоса (6). Затем в60течение 10 мин производили УЗ воздействие при температуре 60 оС на пробы вкартриджах.На следующем этапе через краны-переключатели (5, 7) с помощьюреверсивного насоса (6) в РЕ (8, 9, 10) последовательно подавали по 100 мклэкстрактов, полученных в картриджах (1, 2, 3), 300 мкл 1,7 мМ раствора AlCl3 (5, f)и 300 мкл 0,1 мМ раствора ЦПХ (7, e). Растворы в РЕ (8, 9, 10) перемешивалипотоком воздуха (кран 5, d) в течение 10 с со скоростью 6 мл/мин и выдерживали 5мин при температуре 25 оС.Рисунок 20.
Схема ЦИ-определения флавоноидов в ЛРС: 1, 2, 3 – картриджи сПТФЭ фильтрами; 4 – УЗ-ванна; 6 – перистальтический реверcивный насос; 5, 7 –многоходовые краны-переключатели; 8, 9, 10 – реакционные емкости; 11 –проточная кювета, подключенная с помощью оптоволоконных кабелей кисточнику света и спектрометру.Далее растворы аналитических форм из РЕ (8, 9, 10) при переключениикранов-переключателей (5, 7) и реверса насоса (6) последовательно перекачивали вкювету спектрофотометрического детектора (11), измеряли оптическую плотностьрастворов при длине волны 415 нм в условиях остановленного потока в течение 10с и растворы сбрасывали.
Затем коммуникации системы промывали 70 %раствором этанола (7, d) и измеряли фоновый сигнал при заполнении кюветысмешанным раствором экстракта, 70 % раствора этанола и 0,1 мМ раствора ЦПХ61(1:3:3). Разность сигналов пробы и фона использовалась для расчета содержанияфлавоноидов в ЛРС, при этом удалось устранить матричные эффекты.Для задания порядка необходимых операций и количества реагентовсоставлен алгоритм операций, представленный в Приложении 1 и позволяющийустанавливать состояния управляемых элементов прибора в каждый моментвремени. Аналитические характеристики разработанной методики представлены втаблице 6.
Данная методика в отличие от ранее предложенных проточных аналоговобеспечилаполнуюавтоматизациюанализа,включаястадиюизвлеченияфлавоноидов из ЛРС в раствор. Разработанная методика позволяет проводитьопределение флавоноидов в ЛРС с производительностью 8 проб в час.Таблица6.Аналитическиехарактеристикициклическойинжекционнойспектрофотометрической методики определения флавоноидов в лекарственномрастительном сырье.ПараметрОптимальноезначениеКонцентрация ЦПХ (мМ)0,1Концентрация Al (III) (мМ)1,7Объем экстрагента (мл)2Время извлечения (мин)10Температура извлечения (оС)60Время спектрофотометрическойреакции (мин)5Температура реакции (оС)25Предел обнаружения (%)0,1Диапазон определяемыхконцентраций (%)0,36 – 8Коэффициент корреляции0,999Sr, % (n = 5)3Производительность (проб/час)8624.5.
Мешающее влияние примесных компонентовВ работе было изучено влияние на результаты определения флавоноидовнекоторых соединений, содержащихся в ЛРС и вступающих в реакциикомплексообразованиясионамиалюминия(III),имеющихфенольные,карбоксильные и гидроксильные группы, а также ионов металлов.
Исследованиемешающего влияния было проведено на модельных спиртовых растворах,содержащих 50 мкМ рутина и различные количества примесных компонентов, всоответствии с разработанной автоматизированной методикой. Допустимоезначение было принято при отклонении аналитического сигнала не более, чем на ±5 %. Для оценки селективности реакции использовали фактор селективности,величина которого рассчитывается по уравнению: F=Ci/CА, где Ci – концентрацияпримесного компонента; CА – концентрация аналита. Полученные результатыприведены в таблице 7. Не было найдено мешающего влияния в присутствииаскорбиновой, яблочной, фталевой, малоновой и лимонной кислот, цистеина всоотношении [мешающее соединение]/[рутин] гораздо большем, чем то, чтообычно содержится в ЛРС [123].
По меньшей мере 200-кратный избытокнеорганических ионов, таких как Fe (II/III), Cu (II), Ca (II), Mg (II), Sn (II), Ni (II),Co (II), Mn (II), Cr (III), не влияет на определение флавоноидов. Было обнаруженомешающее влияние сахаров, в том числе глюкозы, при их 10-кратном избытке.Таблица 7. Факторы селективности для различных примесных компонентов приопределении флавоноидов.Примесный компонентФактор селективностиЛимонная кислота2Глюкоза10Аскорбиновая кислота25Яблочная кислота25Фталевая кислота25Малоновая кислота4063Цистеин100Fe (II/III), Sn (II), Cr (III)250Cu (II), Ca (II), Mg (II), Ni (II), Co (II),Mn (II),4504.6. Испытание методики на реальных объектах анализаРазработанная методика была апробирована для определения флавоноидов вразличном ЛРС (Таблица 8).
Расчет содержания флавоноидов в анализируемомрастительном сырье осуществляли в пересчете на рутин, так как все максимумы вспектрах поглощения аналитических форм исследуемого растительного сырьяпрактически совпадали с максимумом поглощения аналитической формы рутина(Рисунок 21).Рисунок 21. Спектры поглощения растворов аналитических форм: 1 – рутина; 2 –травы зверобоя; 3 – цветков ромашки, 4 – цветков календулы (С(рутин) – 0,8 мМ,С(ЦПХ) – 2,8 мМ, С(алюминий хлорид) – 40 мМ).Параллельно определяли суммарное содержание флавоноидов в исследуемыхобъектах референтным методом циклической вольтамперометрии [124].
Последнийпроводился с использованием индикаторного стеклоуглеродного электродаотносительно насыщенного хлорид-серебряного электрода на фоне 0,1 Мфосфатного буферного раствора (рН=6,86) с последующей регистрацией анодных64пиков при постоянно-токовой форме развертки потенциала со скоростью 0,04 В/с.Концентрацию суммарного содержания флавоноидов в ЛРС определяли по высотеанодного пика окисления веществ в диапазоне потенциалов от +0,1 В до +0,6 Вотносительнонасыщенногохлорид-серебряногоэлектрода.Дляэтоговэлектрохимическую ячейку вольтамперометрического анализатора помещали 10мл раствора фонового электролита фосфатного буферного раствора с рН=6,86.Далее в раствор опускали электроды, перемешивали в течение 10 с иостанавливалиперемешивание.Через20сфиксировалициклическуювольтамперограмму.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
