Диссертация (1150109), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Отсутствие пиков свидетельствовало о чистоте фона. Послеэтого в ячейку с фоновым раствором помещали 0,1 мл экстракта ЛРС, полученногоизвлечением 0,1 г пробы растительного сырья 25 мл 70 % этилового спирта накипящей водяной бане в течение 30 мин, перемешивали раствор 10 с, успокаивали20 с и вновь снимали вольтамперограмму в тех же условиях. Анодный пикрегистрировали при потенциале +0,4 B. Концентрацию суммарного содержанияфлавоноидов определяли методом градуировочного графика, построенного постандартномурастворурутинасточноизвестнойконцентрациейприпоследовательном добавлении аликвотных порций в ячейку, измеряя высотуполученного анодного пика (E = +0,4 B) на вольтамперограмме.
Расчет проведен сучетом потери в массе сырья при высушивании.Примеры полученных вольтамперограмм представлены на рисунке 22.65Рисунок 22. Вольтамперограммы, полученные при определении флавоноидов вЛРС: А – цветки ромашки, Б – трава зверобоя (масса пробы – 0,1 г, объем 70 %этилового спирта – 25 мл, время извлечения – 30 мин).Результаты, полученные методами ЦИА с извлечением в УЗ-поле ициклической вольтамперометрии, были сравнены с помощью F- и t-тестов ипредставлены в таблице 8.Полученные F-значения ≤ 6,39 указывают на незначительное различие ввеличинах стандартных отклонений, а полученные t-значения ≤ 2,31 указывают нато, что нет статистически значимого различия между результатами, полученнымипри помощи двух методик.Таблица 8.
Результаты определения содержания флавоноидов в лекарственномрастительном сырье (n=5, P=0,95).Общее содержание флавоноидов*, %ЛРСЦИАЦиклическаяF-значениевольтамперометрия1,205,70,1t-значениеТрава зверобоя5,80,1Цветки ромашки2,200,052,150,041,501,30Цветки календулы1,09±0,031,03±0,041,401,20*в пересчете на рутин1,6366Глава 5.
Разработка методики циклического инжекционногоспектрофотометрического определения аскорбиновой кислоты влекарственном растительном сырье и продуктах питания5.1. Выбор условий спектрофотометрического определения аскорбиновойкислотыДля определения АК в ЛРС выбрана окислительно-восстановительная реакциямежду АК и 2,6-дихлорфенолиндофенолом (2,6-ДФИФ) в кислой среде. Даннаяреакция рекомендована для определения АК в ЛРС Государственной фармакопеейXI издания [73].
2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синююокраску, в кислой – красную, а при восстановлении обесцвечивается. АКвзаимодействует с 2,6-ДФИФ в соотношении 1:1 [125]:HOHOOCHHOONOHOOH2CClHNHOHOCHOCH2OHClOOClOHClOHАскорбиновая2,6-ДФИФКислотаДегидроаскорбиновая2,6-ДФИФКислота(восстановленнаяформа)Продуктами реакции являются дегидроаскорбиновая кислота и лейкосоединение индофенола. При этом наблюдается уменьшение оптической плотностираствора 2,6-ДФИФ при λ=515 нм, т.к. продукты реакции при этой длине волны непоглощают (Рисунок 23).67Рисунок 23.
Спектры поглощения растворов: 1 – лейко-соединение 2,6-ДФИФ(С(ДФИФ) – 38 мкМ, С(HCl) – 0,1 М, С(АК) – 110 мкМ); 2 – 2,6-ДФИФ (С(ДФИФ)– 38 мкМ, С(HCl) – 0,1 М, С(АК) – 14 мкМ).Для достижения оптимальных условий протекания спектрофотометрическойреакции было изучено влияние концентрации соляной кислоты и 2,6-ДФИФ навеличину аналитического сигнала непосредственно в условиях ЦИА.При изучении влияния концентрации соляной кислоты на протеканиеспектрофотометрической реакции через краны-переключатели (5 и 7) с помощьюреверсивного насоса (6) в РЕ (8) подавали 0,25 мл 17 мкМ раствора АК (5, f), 0,1 млраствора соляной кислоты с концентрацией от 1 до 500 мМ (7, a), 0,25 мл раствора2,6-ДФИФ с концентрацией 7 мкМ (7, с) и поток воздуха (5, d) со скоростью 6мл/мин, обеспечивающийперемешивание растворов в РЕ(Рисунок 30).Продолжительность перемешивания раствора в РЕ потоком воздуха составила 10 с.После этого раствор аналитической формы из РЕ (8) при переключениикранов-переключателей (5, 7) и реверса насоса (6) перекачивали в кюветуспектрофотометрического детектора (9), измеряли оптическую плотность раствора(λ=515 нм) в условиях остановленного потока в течение 10 с и раствор сбрасывали.Согласно полученным данным, при прочих равных условиях аналитическийсигнал максимален при концентрации соляной кислоты 5 мМ (Рисунок 24).
Придальнейшемувеличенииконцентрациисолянойкислотыпроисходитпротонирование реагента, и наблюдается уменьшение оптической плотности. Для68дальнейших экспериментов данная концентрация была выбрана в качествеоптимальной.Рисунок 24. Влияние концентрацииРисунок 25. Влияние концентрациисоляной2,6-ДФИФ на оптическую плотностьплотностькислотырастворанаоптическуюаналитическойраствора (С(HCl) – 5 мМ).формы АК (С(ДФИФ) – 7 мкМ, С(АК)– 17 мкМ).При определении АК фиксируется уменьшение оптической плотностираствора 2,6-ДФИФ, пропорционально связанное с концентрацией АК.
Для выбораконцентрации 2,6-ДФИФ через краны-переключатели (5 и 7) с помощьюреверсивного насоса (6) в РЕ (8) подавали 0,25 мл дистиллированной воды (7, d),0,1 мл раствора соляной кислоты с концентрацией 5 мМ (7, a), 0,25 мл раствора2,6-ДФИФ с концентрацией от 8 мкМ до 80 мкМ (7, c) и поток воздуха соскоростью 6 мл/мин (5, d), обеспечивающий перемешивание растворов в РЕ(Рисунок 30).
Продолжительность перемешивания раствора в РЕ потоком воздухасоставила 10 с. После этого раствор из РЕ (8) перекачивали в кюветуспектрофотометрического детектора и измеряли оптическую плотность раствора (λ= 515 нм). В качестве оптимальной была выбрана концентрация 2,6-ДФИФ 20мкМ, обеспечивающая значение оптической плотности 1 (Рисунок 25).
Приувеличении концентрации реагента наблюдается отклонение от закона БугераЛамберта-Бера.Особоевниманиебылоуделенооптимизацииусловийобразованияаналитической формы по времени. При изучении влияния времени перемешивания69реакционной смеси в РЕ на протекание спектрофотометрической реакции черезкраны-переключатели (5 и 7) с помощью реверсивного насоса (6) в РЕ (8) подавали0,25 мл водного экстракта листьев смородины (5, f), 0,1 мл раствора солянойкислоты с концентрацией 5 мМ (7, a), 0,25 мл раствора 2,6-ДФИФ с концентрацией20 мкМ (7, c) и поток воздуха со скоростью 6 мл/мин (5, d), обеспечивающийперемешиваниераствороввРЕ(8)(Рисунок30).Продолжительностьперемешивания раствора в РЕ (8) потоком воздуха варьировалось от 5 до 25 с.После этого раствор аналитической формы из РЕ (8) перекачивали в кюветуспектрофотометрического детектора и измеряли оптическую плотность раствора (λ= 515 нм).Другие восстановители, такие как триозы, присутствующие в ЛРС, способнывступать в реакции восстановления с реагентом.
Однако эти реакции обладаютменьшими константами скоростей реакции по сравнению с константой скоростиреакции АК с 2,6-ДФИФ [126]. Время перемешивания реакционной смеси в РЕЦИА должно быть достаточным, чтобы обеспечить гомогенизацию раствора иисключить возможное взаимодействие реагента с другими восстановителями. Былоустановлено, что при увеличении времени перемешивания более 10 с наблюдаетсяослабление окраски реагента, что связано с влиянием примесных компонентов(Рисунок 26).Рисунок 26.
Зависимость оптической плотности аналитической формы АК отвремени перемешивания (С(ДФИФ) – 20 мкМ, С(HCl) – 5 мМ, скорость потокавоздуха – 6 мл/мин).705.2. Оптимизация процесса извлечения аскорбиновой кислоты излекарственного растительного сырьяДля оптимизации процесса извлечения АК из ЛРС и продуктов питания былоисследовано влияние массы пробы, объема экстрагента и времени извлечения.Степень эффективности извлечения АК рассчитывали на основании результатовдвух последовательных автоматизированных извлечений из одной и той же пробыс последующим спектрофотометрическим детектированием.При изучении влияния массы навески были зафиксированы объемэкстрагента – 1,5 мл и время извлечения в УЗ-ванне (130 Вт, 35 кГц) – 10 мин притемпературе 25 оС.
В картридж помещали от 0,005 до 0,02 г пробы (листьясмородины, красный перец и яблочное пюре) и проводили ЦИ-определение АК поразработанной схеме (пункт 5.3). Далее из этой же пробы проводили вторичноеизвлечение и определение АК. На основании полученных результатов (Рисунок27), масса всех исследованных проб равная 0,01 г была выбрана для дальнейшихэкспериментов.
При увеличении массы навески пробы наблюдается уменьшениеэффективности извлечения АК, связанное с недостаточным объемом экстрагента, ав случае уменьшения массы наблюдается увеличение СКО.Рисунок 27. Зависимость эффективности извлечения АК от массы пробы: A –сладкий красный перец; Б – листья смородины; В – яблочное пюре (объемэкстрагента – 1,5 мл, время извлечения – 10 мин, температура – 25 оС).71При изучении влияния объема экстрагента на полноту извлечения АК изпроб были зафиксированы масса пробы – 0,01 г и время извлечения в УЗ-ванне –10 мин.
Объем экстрагента варьировали в пределах от 0,5 до 2 мл.При изучении влияния времени извлечения АК из проб на примере листьевсмородины были зафиксированы масса навески – 0,01 г и объем экстрагента – 1,5мл. Время перемешивания пробы с экстрагентом в картридже потоком газа или поддействием УЗ варьировали в пределах от 3 до 30 мин.Анализ проводили по описанной в пункте 5.3 схеме. Из полученныхрезультатов (Рисунки 28, 29) следует, что объем экстрагента равный 1,5 мл и времяизвлечения АК в УЗ-поле равное 5 мин являются оптимальными.
Извлечениепроводилось при температуре 25 оС, так как при повышении температуры скоростьразрушения АК возрастает.Рисунок 28. Зависимость эффективности извлечения АК от объема экстрагента: A– сладкий красный перец; Б – листья смородины; В – яблочное пюре (масса пробы– 0,01 г, время извлечения – 10 мин, температура – 25 оС).72Рисунок 29. Зависимость эффективности извлечения АК от времени: А –перемешивание воздухом; Б – УЗ перемешивание (скорость потока воздуха – 6мл/мин, объем экстрагента – 1,5 мл, масса пробы – 0,01 г, температура – 25 оС).5.3. Методика ЦИ-определения аскорбиновой кислоты в ЛРС ипродуктах питанияНа основаниипроведенныхэкспериментов, описанныхвыше, быларазработана методика циклического инжекционного спектрофотометрическогоопределения АК в ЛРС: плодах рябины, листьях смородины; и продуктах питания:сладком красном перце, яблочном пюре, яблоке и киви.В соответствии с разработанной методикой в три съемных картриджа (1, 2, 3)помещали по 0,01 г пробы ЛРС или пищевого продукта (Рисунок 30).
Далее всекартриджи (1, 2, 3) подключали к многоходовому соленоидному крану (5) ипомещали в УЗ-ванну (4). После этого в каждый картридж последовательноподавали по 1,5 мл дистиллированной воды через краны (5 и 7) с помощьюперистальтического насоса (6). Затем в течение 5 мин происходило извлечение АКв водную фазу под действием УЗ.73Рисунок 30. Схема ЦИ-определения АК в ЛРС: 1, 2, 3 – картриджи с ПТФЭфильтрами; 4 – ультразвуковая ванна; 5, 7 – многоходовые краны-переключатели;6 – перистальтический реверcивный насос; 8 – реакционная емкость; 9 – проточнаякювета, подключенная с помощью оптоволоконных кабелей к источнику света испектрометру.После этого последовательно в РЕ (8) направляли 0,25 мл экстракта изкартриджа (1), 0,1 мл 5 мМ раствора соляной кислоты (7, a) и 0,25 мл 20 мкМраствора 2,6-ДФИФ (7, с) и поток воздуха (5, d) со скоростью 6 мл/мин в течение10 с, обеспечивающий интенсивное перемешивание растворов в РЕ.
На следующемэтапе раствор аналитической формы из РЕ (8) при переключении крановпереключателей(5,7)иреверсанасоса(6)перекачиваливкюветуспектрофотометрического детектора (9), измеряли оптическую плотность раствора(λ = 515 нм) в условиях остановленного потока в течение 10 с и растворсбрасывали. На заключительном этапе коммуникации системы промывалидистиллированной водой (7, d) и измеряли фоновый сигнал при заполнениикюветы смешанным раствором полученного экстракта, 5 мМ раствора солянойкислоты и дистиллированной воды (2,5:1:2,5).После промывки системыпроводили детектирование АК в экстрактах, полученных во втором и третьемкартриджах (2, 3).Для задания порядка необходимых операций и количества реагентовсоставлен алгоритм операций, представленный в Приложении 2, позволяющий74устанавливать состояния управляемых элементов прибора в каждый моментвремени.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
