Диссертация (1145828), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Клетки штамма К535В-Д924-cdc28-4 при 37°С приобретают более удлиненную форму по сравнению склетками того же штамма при температуре 22°C (рисунок 31). Клетки с мутацией cdc28-4крупнее клеток дикого типа, часто слипаются, а образовавшиеся почки не всегдаотделяются от материнской клетки (рисунок 31).
Таким образом, мы получили данные,согласующиеся с ранее опубликованными [190, 191]. Мы также наблюдали, что у клеток смутацией cdc28-4 после инкубации при 37°С при их окрашивании DAPI происходитокрашивание не только ядерной, но и митохондриальной ДНК. Чем дольше клеткиподвергались действию повышенной температуры, тем больше окрашенной ДНКмитохондрий мы наблюдали. Это может быть связано с тем, что для мутантов cdc28-4 внепермиссивных условиях характерно изменение морфологии митохондрий и ихфрагментация [193].
Мы показали, что плотность клеточной культуры cdc28-4 послеперемещения ее с 22°С в 37°С продолжает увеличиваться в течение 6 часов, а затем неменяется. Время удвоения клеток с мутацией cdc28-4 при температуре 22°С составилооколо 4 часов.84Рисунок 31. Живые клетки штаммов wt и cdc28-4, окрашенные флуоресцентнымкрасителем DAPI. Все фотографии получены при одинаковом увеличении.При 22°С культура мутантного штамма cdc28-4 не синхронизирована и неотличается от культуры штамма дикого типа по соотношению клеток, находящихся наразных стадиях клеточного цикла (рисунок 32 А, Г).
Наши результаты, полученные спомощью проточной цитометрии, показывают, что синхронизация клеток cdc28-4наступает при 37°C, поскольку при повышенной температуре наблюдается единственныйпик на диаграммах проточной цитометрии (рисунок 32 Д). Эксперименты по проверкестепени синхронизации с помощью проточной цитометрии показали, что длясинхронизации клеток с мутацией cdc28-4 достаточной является инкубация приповышенной температуре в течение 2-4 часов, а после снятия блокирующего клеточныйцикл воздействия путем перенесения культуры в 22°С синхронизация сохраняется какминимум еще одно клеточное деление (рисунок 32 Е).85Рисунок 32. Оценка степени синхронизации клеток дрожжей штаммов K5-35-Д924(панели А-В) и K5-35-Д924-cdc28-4 (панели Г-Е) с помощью проточной цитометрии.Ночную культуру клеток разводили в 10 раз и растили 2-4 часа при различнойтемпературе: A) и Г) 2 часа при 22°С; Б) и Д) 4 часа при 37°С; В) и Е) 4 часа при 37°С споследующей инкубацией при 22°С в течение 2 часов.863.6.2.
Тест на "незаконную" гибридизацию с использованием синхронизированныхна стадии G1 дрожжевых культурС использованием альфа-теста мы определили значение частоты наследуемых иненаследуемых генетических изменений, индуцированных УФ излучением в клеточныхкультурах, заблокированных на стадии G1 клеточного цикла, а также в асинхронныхкультурах клеток дрожжей. В исследовании использовали изогенные штаммы: штаммдикого типа К5-35В-Д924 и штамм, несущий мутацию cdc28-4. Альфа-тест с культурами,синхронизированными на стадии G1, проводили следующим образом. Клетки штамма wtи мутантного штамма cdc28-4 высевали на чашки с полной твердой средой иинкубировали 2 часа при температуре 37оС.
За это время абсолютное большинство клетокмутантного штамма cdc28-4, но не штамма wt, переходит в стадию G1 клеточного цикла.Для индукции повреждений ДНК дрожжевые клетки облучали УФ излучением, после чегок ним дополнительно подсевали клетки штамма Д-926, являющегося партнером дляскрещивания. В случае отрицательного контроля процедуру проводили тем же способомза единственным исключением: клетки не облучали УФ светом.
Чашки инкубировалидвое суток. Часть чашек помещали в термостат с температурой 22оС, таким образомклетки штамма cdc28-4 выходили из блока на стадии G1 и могли продвигаться дальше поклеточному циклу. Другую часть чашек инкубировали при 37оС, и в этом случае блокклеточного цикла на стадии G1 у мутанта cdc28-4 сохраняется на протяжении всеговремени инкубирования при 37°С. Таким образом, в данном исследовании использовали 8вариантов экспериментальных условий: штамм дикого типа (wt) без воздействия УФизлучения, инкубация при температуре 22оС (А) и 37оС (Б) после "незаконного"скрещивания, и при воздействии УФ излучения, инкубация при температуре 22оС (В) и37оС (Г), штамм с мутаций cdc28-4 без воздействия УФ излучения, инкубация притемпературе 22оС (Д) и 37оС (Е) после "незаконного" скрещивания, и при воздействии УФизлучения, инкубация при температуре 22оС (Ж) и 37оС (З) (рисунок 33).87Рисунок33.Схемаэкспериментассинхронизированнымикультурами(клеткиблокированы на стадии G1) в альфа-тесте.У штамма дикого типа под действием УФ излучения при температуре 22оСпроисходит возрастание частоты "незаконной" гибридизации в 12 раз, а также возрастаетчастота всех событий, учитываем в тесте на "незаконную" гибридизацию (рисунок 34),что совпадает с результатами, полученными ранее [16, 17].
При температуре 37оС поддействием УФ излучения у штамма дикого типа также наблюдается увеличение частоты"незаконной" гибридизации, приблизительно в 5 раз (рисунок 34), а также происходитизменение распределения долей выявляемых генетических событий в процентномсоотношении (рисунок 35). Под действием УФ излучения при температуре 37оС у штаммадикого типа возрастает доля класса "мутации и временные повреждения" и уменьшаетсядоля классов "потеря хромосомы III" и "потеря правого плеча хромосомы III" посравнению со всеми остальными экспериментальными вариантами: без воздействия УФпри температуре 37оС, а также без воздействия УФ и при воздействии УФ при88температуре 22оС (рисунок 34. А,Б,В,Г) (приложение Т).
Возрастание частоты класса"мутации и временные повреждения" до 59% от всех выявляемых в альфа-тесте событийможно объяснить тем, что клетки дикого типа при воздействии температуры 37оСиспытывают тепловой шок средней тяжести, что приводит к нарушению белковогосинтеза и временной задержке клеток на стадии G1 [194-197].
Возможно, при 37оСпроисходит частичная синхронизация культуры клеток дикого типа на стадии G1, чтоприводит к возрастанию частоты фенотипического проявления первичных поврежденийеще до их устранения репарацией, и как следствие возрастает доля класса "мутации ивременные повреждения", а меньшая доля первичных повреждений приводит к потерехромосомы III и ее правого плеча уже после скрещивания и формирования "незаконного"гибрида.Рисунок 34.
Отношение общей частоты "незаконной" гибридизации, а также частотыкаждого из учитываемых событий в дрожжевых культурах, обработанных УФизлучением, к частоте тех же событий, возникших спонтанно, в культурах штаммов wt иcdc28-4 при температуре 22°С или 37°С.Примечание:OЧГ – Общая частота "незаконной" гибридизацииПХ – Потеря хромосомы IIIППХ – Потеря правого плеча хромосомы IIIМВП – Мутации и временные повреждения в локусе MATα.89Рисунок 35. Доля классов генетических событий, выявляемых в тесте на "незаконную"гибридизацию при различных экспериментальных условиях: штамм дикого типа (wt) безоблучения УФ излучением, инкубация при температуре 22оС (А) и 37оС (В) после"незаконного" скрещивания; штамм дикого типа (wt) на фоне воздействии УФ излучения,инкубация при температуре 22оС (Б) и 37оС (Г) после "незаконного" скрещивания; штаммс мутаций cdc28-4 без воздействия УФ илучением, инкубация при температуре 22оС (Д) и37оС (Ж) после "незаконного" скрещивания; штамм с мутаций cdc28-4 при воздействииУФ излучением, инкубация при температуре 22оС (Е) и 37оС (З) после "незаконного"скрещивания.Примечание:Доза УФ облучения составляла 17 Дж/м2.Подчеркиванием отмечено достоверное изменение доли класса генетических событийпосле обработки УФ по сравнению с долей тех же событий, возникших спонтанно, приодинаковых температурах (достоверность значений определяли по z-критерию (Р<0,05)).90У штамма с мутацией cdc28-4, который был предварительно заблокирован настадии G1, а потом "отпущен", т.е.
после облучения и добавления штамма-партнера дляскрещивания Д926 был перенесен в термостат с температурой 22оС (вариантэкспериментальных условий Е (рисунок 33)) УФ излучение индуцирует "незаконную"гибридизацию в 3 раза по сравнению со спонтанным уровнем в тех же условиях (рисунок34), а распределение классов генетических событий не отличается от распределениясоответствующих классов, полученных спонтанно у мутанта cdc28-4 и wt (рисунок 35)(приложение Т). При сохранении постоянного блока клеток на стадии G1 частота"незаконной" гибридизации, индуцированная УФ излучением, возрастала больше всего (в16 раз), особенно сильно (в 49 раз) увеличивалась частота класса "мутации и временныеповреждения", по сравнению со спонтанным уровнем при той же температуре (рисунок34) (приложение Т).
Анализ распределения долей классов в процентном соотношениипоказывает, что в том случае, когда клетки были заблокированы на стадии G1 постоянно,доля класса "мутации и временные повреждения" возрастала до 89%, а доля классовпотеря хромосомы III и ее правого плеча уменьшалась (рисунок 35). Мы предполагаем,что это увеличение происходит за счет временных повреждений в локусе MATα, т.е. засчет тех первичных повреждений, которые проявляются фенотипически еще до ихустранения системами репарации.
Для проверки этой гипотезы мы провели тест на"незаконную" цитодукцию на культурах клеток дрожжей, заблокированных на стадии G1.3.6.3. Тест на "незаконную" цитодукцию с использованием дрожжевых культур,заблокированных на стадии G1Тест на "незаконную" цитодукцию проводили с использованием тех жеэкспериментальных условий, что и тест на "незаконную" гибридизацию, в соответствие сосхемой, представленной на рисунке 33. Мы показали, что в тесте на "незаконную"цитодукцию у штаммов wt и cdc28-4 возрастание частоты временных повреждений поддействием УФ-излучения наблюдалась как при температуре 22оС, так и при 37оС посравнению со спонтанным уровнем при тех же значениях температуры (рисунок 36 А.
Б).Для того, чтобы выявить возможные различия между действием УФ-излучения наасинхронные и заблокированные на стадии G1 клеточные культуры мы определилииндуцированную УФ-излучением частоту класса "первичные повреждения" у штаммов wtи cdc28-4 при температуре 22°С и 37°С (рисунок 36). Полученные результаты указываютна то, что при 37°С, когда у штамма cdc28-4, но не wt, наступает блок клеточных деленийна стадии G1, индуцированная частота класса "временные повреждения" у мутанта cdc284 в 6 раз превышает индуцированную частоту тех же событий у wt (рисунок 36 Б).
Другая91картина наблюдается при 22°С, когда блока клеточных делений не наступает и клеткиобоих штаммов продолжают движение по клеточному циклу. Хотя в этом случаеиндуцированная частота у штамма cdc28-4 выше, чем у штамма wt, разница междуштаммами меньше, чем при температуре 37°С: индуцированная частота у штамма cdc28-4в 3 раза выше, чем у штамма wt.Рисунок 36. Индуцированная УФ-излучением частота временных повреждений в локусеMATα у штамма дикого типа и мутанта cdc28-4 при температуре (А) 22оС и (Б) 37оСПримечание: индуцированная частота – это разность частоты при воздействии УФ ичастоты без воздействия.В отличие от штамма дикого типа, у штамма cdc28-4 при сохранении постоянногоблока на стадии G1 при воздействии УФ изменяется соотношение классов генетическихсобытий, выявляемых в тесте на «незаконную» цитодукцию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
