Диссертация (1145828), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Проводя анализфенотипа"незаконных"гибридовицитодуктантов,можноопределитьспектргенетических событий, которые привели к смене типа спаривания тестерного штамма вусловияхкакспонтанной,такииндуцированнойразличнымивоздействиями"незаконной" гибридизации или цитодукции.Тем не менее, при использовании альфа-теста нужно помнить о некоторыхограничениях. Одно из них связано с неравномерным распределением долей классовучитываемых событий. Это приводит к затруднениям при оценке изменений частотывозникновения редких классов генетических событий, таких как генная конверсия ирекомбинация, выявляемых в тесте на "незаконную" гибридизацию. Доля гибридов,возникших спонтанно в результате реципрокной рекомбинации между локусом МАТα икассетой HMRa, составляет 0,4-0,6%, а доля гибридов, возникших в результате конверсиикассеты HMRa в локус MATα, составляет 1,4-4,5% от общего числа "незаконных"гибридов.
Поэтому при индукции "незаконной" гибридизации какими-либо мутагеннымивоздействиями изменение доли этих классов может быть замаскировано повышениемдоли гибридов, возникших в результате потери хромосомы III, ее правого плеча или106мутаций и временных повреждений, в силу случайных причин. Так, для того чтобы найти10 гибридов, возникших в результате рекомбинации, необходимо проверить 2000гибридов, что сопряжено с объективными трудностями, поскольку требует большихтрудовых и материальных затрат.
Поэтому для достоверной оценки изменения частотывозникновения гибридов редких классов при воздействии мутагеном мы можемрекомендовать изменить селективные условия таким образом, чтобы исключить из учетанаиболее частые события и увеличить таким образом долю редких классов. Этот подходбыл успешно применен нами при изучении эффекта ГАП в альфа-тесте.
Так, в ходепроверки эффекта ГАП в тесте на "незаконную" гибридизацию мы обнаружилиповышение частоты классов "конверсия" и "рекомбинация" (приложение А), а излитературных данных о механизме действия этого мутагена известно, что у дрожжей ГАПне индуцирует конверсию и рекомбинацию [214]. Для того чтобы точнее определить какменяется частота конверсии и рекомбинации под действием ГАП, мы подобрали такуюселективную среду для отбора гибридов, на которой не могут расти гибриды, потерявшиехромосому III, которые обычно составляют до 50% от всех выявляемых событий.
Этотподход позволил повысить вероятность выявления гибридов, возникших в результатеконверсии и рекомбинации. Мы смогли с наименьшими затратами отобрать большеечисло гибридов редких классов и точнее оценить изменение частоты их возникновенияпод действием ГАП. В результате мы показали, что ГАП не индуцирует частоту никонверсии, ни рекомбинации, а эффект обнаруженный при проведении альфа-теста вполном варианте связан с проблемой статистической обработки данных (приложение В).Таким образом, альфа-тест не лишен недостатков и имеет ряд ограничений, как илюбой метод генетической токсикологии. Тем не менее, параллельное проведение"незаконной" гибридизации и цитодукции с использованием культур, находящихся встадии логарифмического роста, и соблюдение одинаковых физических условий припостановкеэксперимента,позволяетизучатьраспределениенаследуемыхиненаследуемых генетических изменений при воздействии агентами, вызывающиминарушения различных типов.
Для повышения точности оценки частоты рекомбинации иконверсии в альфа-тесте необходимо проводить дополнительный анализ в тесте на"незаконную" гибридизацию с применением селективных сред, исключающих отборгибридов,возникающихврезультатепотерихромосомыIII.Дополнительныепреимущества появляются при использовании культур, синхронизированных на стадииG1.107ЗаключениеС использованием альфа-теста мы оценили спектр и частоту наследуемых иненаследуемых изменений генетического материала, возникающих на фоне индукциипервичных повреждений ДНК различных типов.
Мы показали, что возможностьфенотипического проявления первичных повреждений ДНК в альфа-тесте зависит от типапервичного повреждения и стадии клеточного цикла, в которой произошло этоповреждение. Модификации оснований, пиримидиновые димеры и 6-4 фотопродукты,возникшие как на стадии G1, так и на стадиях S и G2, могут проявляться в альфа-тестефенотипически еще до устранения их системами репарации. Неспаренности оснований вальфа-тесте проявляются только после их нетождественного устранения системамирепарации в виде наследуемых изменений.
Фенотипическое проявление двунитевыхразрывов в альфа-тесте возможно только в том случае, если они возникли на стадии G1.Двунитевые разрывы, возникшие на других стадиях клеточного цикла, могут быть учтеныв альфа-тесте только после их превращения в наследуемые изменения генетическогоматериала. Разрывы ДНК в большей степени нарушают все матричные процессы ипоэтому в ходе клеточного цикла обязательно должны быть устранены, в отличие отмодификаций оснований, которые могут сохраняться в ДНК в течение несколькихклеточных циклов. Повреждения ДНК, индуцированные УФ-излучением, благодарямеханизмам, обеспечивающих временную устойчивость клетки к повреждениям, такжемогут существовать в клетке какое-то время и успеть проявиться фенотипически, дажеесли эти повреждения возникли на стадиях S, G2 или М.108Выводы1.Неспаренности оснований не проявляются фенотипически в использованнойсистеме и могут быть учтены в альфа-тесте только после их закрепления в форменаследуемых изменений генетического материала.2.Модификации оснований, повреждения ДНК, индуцированные ультрафиолетовымизлучением, и двунитевые разрывы ДНК могут проявляться фенотипически в альфа-тестееще до их устранения системами репарации.3.Первичные повреждения, возникшие на стадии G1 клеточного цикла, могутнезамедлительно, в пределах той же стадии клеточного цикла приводить к переключениютипа спаривания дрожжевых клеток α → а и таким образом проявляться фенотипически.4.Модификации оснований и повреждения, индуцированные ультрафиолетовымизлучением, появившиеся на стадиях S или G2, могут без изменения достигать стадии G1,в которой становится возможным их собственное фенотипическое проявление.5.Двунитевые разрывы, возникшие на стадиях S или G2 клеточного цикла, не имеютсамостоятельного фенотипического проявления и могут быть учтены в альфа-тесте послеих превращения в наследуемые изменения генетического материала.6.В альфа-тесте вероятность фенотипического проявления первичных повреждений,возникших на стадиях S или G2 клеточного цикла, зависит от их способности нарушатьрепликацию.7.Потеря хромосомы III не ведет к мгновенной гибели клеток дрожжей, индуцируетпереключение типа спаривания α → а и не нарушает их способность к гибридизации.109Список литературы1.Абилев С.
К., Глазер В. М. Мутагенез с основами генетоксикологии: учебноепособие. — СПб: Нестер-История, 2015. — 304 с.2.Hoeijmakers J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer // Nature. —2001. — T. 411, № 6835. — C. 366-74.3.Hoeijmakers J. H. DNA damage, aging, and cancer // N Engl J Med. — 2009. — T. 361,№ 15. — C.
1475-85.4.Friedberg E. C., Walker G. C., Siede W., Wood R. D., Schultz R. A., Ellenberger T.DNA repair and mutagenesis. Second edition —Washington, D. C.: ASM Press, 2006. — 1118с.5.Bernstein C., Prasad A. R., Nfonsam V., Bernstein H. DNA Damage, DNA Repair andCancer // New Research Directions in DNA Repair / Chen C.InTech, 2013. — C. 413-465.6.Pages V., Fuchs R. P. How DNA lesions are turned into mutations within cells? //Oncogene. — 2002. — T. 21, № 58. — C. 8957-66.7.Sugasawa K.
Xeroderma pigmentosum genes: functions inside and outside DNA repair //Carcinogenesis. — 2008. — T. 29, № 3. — C. 455-65.8.Chen S., Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance // J Clin Oncol.— 2007. — T. 25, № 11. — C. 1329-33.9.Cancer Genome Atlas N. Comprehensive molecular characterization of human colon andrectal cancer // Nature. — 2012. — T. 487, № 7407. — C. 330-7.10.Pierce B. A. Genetics: A Conceptual Approach Fourth Edition. — New York: W.H.Freeman, 2012. — 857 с.11.Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular Biology ofthe Cell Sixth Edition.
— New York: Garland Science, 2015. — 1465 с.12.Kumari S., Rastogi R. P., Singh K. L., Singh S. P., Sinha R. P. DNA Damage: DetectionStrategies // EXCLI Journal. — 2008. — T. 7. — C. 44-62.13.Liao W., McNutt M. A., Zhu W. G. The comet assay: a sensitive method for detectingDNA damage in individual cells // Methods. — 2009. — T. 48, № 1. — C. 46-53.14.Репневская М. В., Кашкин П.
К., Инге-Вечтомов С. Г. Модификационныеизменения генетического материала у дрожжей сахаромицетов // Генетика. — 1989. — T.25, № 3. — C. 425-436.15.Инге-Вечтомов С. Г., Репневская М. В., Карпова Т. С. Изучение скрещиваниеклеток одинакового типа спаривания у дрожжей сахаромицетов // Генетика. — 1986. — T.22, № 11. — C. 2625-2636.11016.Степченкова Е. И., Коченова О. В., Инге-Вечтомов С. Г. «Незаконная»гибридизация и «незаконная» цитодукция у гетероталличных дрожжей Saccharomycescerevisiae как система для анализа генетической активности экзогенных и эндогенныхфакторовв«альфа-тесте»//ВестникСанкт-Петербургскогогосударственногоуниверситета.
— 2009. — T. 3, № 4. — C. 129-140.17.Kochenova O. V., Soshkina J. V., Stepchenkova E. I., Inge-Vechtomov S. G.,Shcherbakova P. V. Participation of translesion synthesis DNA polymerases in the maintenanceof chromosome integrity in yeast Saccharomyces cerevisiae // Biochemistry (Mosc). — 2011.
—T. 76, № 1. — C. 49-60.18.Inge-Vechtomov S. G., Pavlov Y. I., Noskov V. N., Repnevskaya M. V., Karpova T. S.,Khromov-Borisov N. N., Chekuolene J., Chitavichus D. Tests for genetic activity in the yeastSaccharomyces cerevisiae: Study of forward and reverse mutation, mitotic recombination andillegitimate mating induction // Progress in mutation research. Evaluation of short-term tests forcarcinogens: Report of the International Programme on Chemical Safety's collaborative study onin vitro assays —Amsterdam, The Netherlands Elsevier 1985. — C.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
