Главная » Просмотр файлов » Диссертация

Диссертация (1145828), страница 17

Файл №1145828 Диссертация (Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae) 17 страницаДиссертация (1145828) страница 172019-06-29СтудИзба
Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 17)

В основе различной субстратной специфичности репликативных и TLS ДНКполимераз лежат структурные предпосылки: в отличие от репликативных ДНК-полимеразактивный сайт ДНК-полимеразы Pol η более открытый, в нем могут помещаться крупныемодифицированные основания и циклобутановые тиминовые димеры, которые по размерупревосходят активный сайт репликативных ДНК-полимераз [203]. TLS ДНК-полимеразаPol ζ с меньшей точностью, чем ДНК-полимераза Pol η, может обходить сis-synтиминовые димеры, а также повреждения других типов c разной эффективностью, в томчисле, 6-4 фотопродукты [204-206]. Поэтому привлечение специфических TLS ДНКполимераз снимает блок репликации.

Таким образом, благодаря существованию синтеза вобход повреждений, клетки приобретают возможность завершить удвоение ДНК сповреждениями, блокирующими вилку репликации. Эти повреждения устраняет позжесистема репарации ДНК с неспаренными основаниями на стадии S или гомологичнаярекомбинация на стадии G2. Помимо синтеза в обход повреждений, временнуюустойчивость к повреждениям также обеспечивает гомологичная рекомбинация. В обоихслучаях повреждение сохраняется в ДНК [207-210]. Благодаря этим механизмам частьповреждений может без изменений перейти из стадии S в стадию G2 клеточного цикла исохраняться в ДНК до устранения системами репарации на более поздних стадиях или вследующем клеточном цикле [207].В зависимости от типа повреждения ДНК и стадии клеточного цикла, на которойоно возникло, различные системы репарации участвуют в его устранении [132].Двунитевые разрывы, возникшие на стадии G1, устраняет система негомологичногосоединения концов.

У дрожжей негомологичное соединение концов является минорным98путем устранения двунитевых разрывов [211, 212], которые в основном устраняет системагомологичной рекомбинации на стадиях S и G2 [132, 213]. Модификации основанийустраняют белки эксцизионной репарации оснований на стадии G1. Репарацию ДНК сповреждениями, индуцированными УФ-излучением, главным образом осуществляетэксцизионная репарация нуклеотидов на стадии G1. Белки эксцизионной репарациинуклеотидов активны не только на стадии G1, но и совместно с белками гомологичнойрекомбинации участвуютвустранениидвунитевыхразрывов прирепликации.Неспаренности оснований, делеции или инсерции длиной в несколько нуклеотидов,возникшие при репликации, устраняет система репарации ДНК с неспареннымиоснованиями.

Если повреждение по каким-то причинам не устраняется на стадии G1 исохраняется в ДНК до стадии S, то оно может блокировать репликацию. Тем не менее, невсе первичные повреждения блокируют матричные процессы. Например, модификацииоснований не вызывают остановку репликации или транскрипции и могут существовать вклетке несколько клеточных циклов, а для их превращения в мутацию необходимо 2 или 3раунда репликации [150, 155].

Для аналогов оснований показано, что основныерепликационные ДНК полимеразы Pol ε и Pol δ в ходе синтеза ДНК могут подставлятьГАП вместо аденина или реже вместо гуанина, при этом 3' - 5' экзонуклеазная активностьэтихДНК-полимеразможетисправлятьнесоответствиеоснований,вызванноевстраиванием ГАП [214]. ДНК-полимераза Pol δ может осуществлять синтез на матрице,содержащей 8-ОГ, подставляя аденин напротив 8-ОГ, но не очень эффективно [153, 215].Благодаря скоординированной работе ДНК-полимераз Pol δ и Pol ζ, которая осуществляетсинтез в обход повреждений, повышается эффективность этого процесса [199].

8-ОГможет точно и эффективно обходить ДНК-полимераза Pol η, которая в отличие отрепликативных ДНК-полимераз подставляет цитозин напротив этого повреждения [134].Это позволяет модификациям оснований сохраняться в клетке несколько клеточныхциклов еще до их превращения в мутации.Для того, чтобы проследить судьбу первичных повреждений от момента ихвозникновения до устранения системами репарации в зависимости от стадии клеточногоцикла, незаменимым инструментом оказался альфа-тест. Это возможно не только потому,что с помощью альфа-теста можно фиксировать самостоятельное фенотипическоепроявление первичных повреждений, но и вследствие тесной связи генетическогоконтроля типа спаривания у дрожжей с клеточным циклом.

Кроме того, нам удалосьсущественно увеличить разрешающую способность альфа-теста при переходе наиспользование культур, заблокированных на стадии G1, исключительно на которой99возможна гибридизация дрожжевых клеток. Однако прежде чем переходить к анализурезультатов, полученных с использованием заблокированных на стадии G1 дрожжевыхкультур, важно понять, сколько времени необходимо клеткам гетероталличных дрожжейдля переключения типа спаривания α → а на уровне фенотипа. Согласно литературнымданным, в норме при транспозиции кассеты в локус MAT и замещении MATα на MATa угомоталличных дрожжей переключение типа спаривания происходит достаточно быстро,за один клеточный цикл [97]. При этом в клетке, переключившей тип спаривания с α на a,должно одновременно происходить быстрое отключение экспрессии STE3, кодирующегорецептор для а-фактора, прекращаться синтез α-фактора, а также запускаться экспрессияSTE2, кодирующего рецептор для α-фактора, и синтезироваться а-фактор [97].

Мыпоказали, что клеткам гетероталличных дрожжей при переключении типа спаривания α →а не нужно проходить полный клеточный цикл для избавления от продуктов,специфичных для клеток α типа спаривания, и они могут скрещиваться на той же стадииG1, на которой произошло это переключение типа спаривания. Это заключение следует изданных о том, что клетки с мутацией cdc28-4, заблокированные на стадии G1 притемпературе 37оС, не могут перейти на следующую стадию клеточного цикла, но онипереключают свой тип спаривания, вследствие нарушения экспрессия MATα, и на той жестадии вступают в скрещивание, частоту которого мы оценили в тестах на "незаконную"гибридизацию и цитодукцию.Для анализа данных, полученных с помощью альфа-теста, важно также ответить навопрос о том, не препятствуют ли такие существенные нарушения в локусе МАТα, какразрывы, протяженные делеции или даже потеря плеча или целой хромосомы IIIскрещиванию дрожжевых клеток.

Мы попытались ответить на этот вопрос, изучив вальфа-тесте генетическую активность камптотецина и эффект индукции транскрипции вцентромере хромосомы III. Камптотецин существенно индуцирует частоту наследуемыхизменений генетического материала, в том числе, потерь хромосом III (рисунок 26), атакже первичных повреждений (рисунок 27). Наши данные о том, что потеря хромосомыIII не препятствует скрещиванию клеток дрожжей, а, наоборот, существенно стимулируетобразование "незаконных" гибридов (рисунок 29), важны для понимания того, когдадвунитевые разрывы, индуцированные камптотецином, инициируют потерю хромосомыIII (до или после скрещивания) и могут ли двунитевые разрывы проявлятьсяфенотипически. Клетки дрожжей могут скрещиваться только в стадии G1 [83, 85].Основное воздействие камптотецин оказывает в стадии S, вызывая появление двунитевыхразрывов при нарушении работы топоизомеразы I в ходе репликации [161, 162].

Ранее в100нашей лаборатории при исследовании эффекта камптотецина в альфа-тесте на фонеинактивации гомологичной рекомбинации, было показано, что штаммы с мутацией rad52не способны расти на среде с камптотецином, а также камптотецин не индуцирует"незаконную" гибридизацию у этих штаммов (А. А. Ширяева, личное сообщение). Этопроисходит потому, что двунитевые разрывы, индуцированные камптотецином, в стадииS в отсутствии гомологичной рекомбинации остаются не устраненными, клеткиостанавливаются и не могут перейти в следующую стадию, и, следовательно, не могутдостичь стадии G1, где они могли бы вступить в копуляцию, и таким образом выжить.

Изэтих данных следует, что двунитевые разрывы, индуцированные камптотецином настадии S, к стадии G1, когда возможно скрещивание дрожжевых клеток, в ходенетождественной рекомбинационной репарации превращаются в генные мутации илиинициируют потерюхромосомыIII, ееправого плеча,генную конверсию ирекомбинацию. Поэтому при воздействии камптотецином переключение типа спариванияв основном происходит уже после завершения репарации ДНК с двунитевыми разрывамии закрепления первичных повреждений в форме наследуемых изменений.

Тем не менее,под действием камптотецина мы зафиксировали увеличение частоты "незаконной"цитодукции, которое происходит за счет класса временных повреждений (рисунок 27).Именно этот класс отражает долю тех первичных повреждений, которые успелипроявиться фенотипически еще до момента репарации ДНК с этим повреждением, т.е.привели к переключению типа спаривания и формированию "незаконного" гибрида илицитодуктанта. Эти данные указывают на то, что в тесте на "незаконную" цитодукциюкакая-то часть двунитевых разрывов успевает проявиться фенотипически еще до ихустранения системой рекомбинационной репарации на стадии S/G2. Мы предполагаем,что индукция частоты временных повреждений в тесте на "незаконную" цитодукциюпроисходит за счет тех двунитевых разрывов, которые возникают на стадии G1, например,при блокировании камптотецином топоизомеразы I, которая участвует не только врепликации, но и в транскрипции и структурной реорганизации хроматина [164, 216, 217].Показано, что топоизомеразы I и II, контролируя суперспирализацию ДНК, участвуют вовсех стадиях транскрипции: инициации, элонгации и терминации.

Характеристики

Список файлов диссертации

Фенотипическое проявление повреждений генетического материала, учитываемых в альфа-тесте у дрожжей Saccharomyces cerevisiae
Свежие статьи
Популярно сейчас
Как Вы думаете, сколько людей до Вас делали точно такое же задание? 99% студентов выполняют точно такие же задания, как и их предшественники год назад. Найдите нужный учебный материал на СтудИзбе!
Ответы на популярные вопросы
Да! Наши авторы собирают и выкладывают те работы, которые сдаются в Вашем учебном заведении ежегодно и уже проверены преподавателями.
Да! У нас любой человек может выложить любую учебную работу и зарабатывать на её продажах! Но каждый учебный материал публикуется только после тщательной проверки администрацией.
Вернём деньги! А если быть более точными, то автору даётся немного времени на исправление, а если не исправит или выйдет время, то вернём деньги в полном объёме!
Да! На равне с готовыми студенческими работами у нас продаются услуги. Цены на услуги видны сразу, то есть Вам нужно только указать параметры и сразу можно оплачивать.
Отзывы студентов
Ставлю 10/10
Все нравится, очень удобный сайт, помогает в учебе. Кроме этого, можно заработать самому, выставляя готовые учебные материалы на продажу здесь. Рейтинги и отзывы на преподавателей очень помогают сориентироваться в начале нового семестра. Спасибо за такую функцию. Ставлю максимальную оценку.
Лучшая платформа для успешной сдачи сессии
Познакомился со СтудИзбой благодаря своему другу, очень нравится интерфейс, количество доступных файлов, цена, в общем, все прекрасно. Даже сам продаю какие-то свои работы.
Студизба ван лав ❤
Очень офигенный сайт для студентов. Много полезных учебных материалов. Пользуюсь студизбой с октября 2021 года. Серьёзных нареканий нет. Хотелось бы, что бы ввели подписочную модель и сделали материалы дешевле 300 рублей в рамках подписки бесплатными.
Отличный сайт
Лично меня всё устраивает - и покупка, и продажа; и цены, и возможность предпросмотра куска файла, и обилие бесплатных файлов (в подборках по авторам, читай, ВУЗам и факультетам). Есть определённые баги, но всё решаемо, да и администраторы реагируют в течение суток.
Маленький отзыв о большом помощнике!
Студизба спасает в те моменты, когда сроки горят, а работ накопилось достаточно. Довольно удобный сайт с простой навигацией и огромным количеством материалов.
Студ. Изба как крупнейший сборник работ для студентов
Тут дофига бывает всего полезного. Печально, что бывают предметы по которым даже одного бесплатного решения нет, но это скорее вопрос к студентам. В остальном всё здорово.
Спасательный островок
Если уже не успеваешь разобраться или застрял на каком-то задание поможет тебе быстро и недорого решить твою проблему.
Всё и так отлично
Всё очень удобно. Особенно круто, что есть система бонусов и можно выводить остатки денег. Очень много качественных бесплатных файлов.
Отзыв о системе "Студизба"
Отличная платформа для распространения работ, востребованных студентами. Хорошо налаженная и качественная работа сайта, огромная база заданий и аудитория.
Отличный помощник
Отличный сайт с кучей полезных файлов, позволяющий найти много методичек / учебников / отзывов о вузах и преподователях.
Отлично помогает студентам в любой момент для решения трудных и незамедлительных задач
Хотелось бы больше конкретной информации о преподавателях. А так в принципе хороший сайт, всегда им пользуюсь и ни разу не было желания прекратить. Хороший сайт для помощи студентам, удобный и приятный интерфейс. Из недостатков можно выделить только отсутствия небольшого количества файлов.
Спасибо за шикарный сайт
Великолепный сайт на котором студент за не большие деньги может найти помощь с дз, проектами курсовыми, лабораторными, а также узнать отзывы на преподавателей и бесплатно скачать пособия.
Популярные преподаватели
Добавляйте материалы
и зарабатывайте!
Продажи идут автоматически
6417
Авторов
на СтудИзбе
307
Средний доход
с одного платного файла
Обучение Подробнее