Диссертация (1145828), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Мы обнаружили, что излучение с длиной волны 365 нм обладаетсобственным мутагенным эффектом и в дозе 36000 Дж/м2 повышает частоту мутированияв среднем в два раза (приложение Л). О том, что фотореактивация при такой дозе имеетместо, можно судить по тому факту, что выживаемость при облучении УФ излучением Атипа не уменьшалась по сравнению со спонтанным уровнем, а при совместном облученииУФ излучением С-типа и УФ излучением А-типа выживаемость возрастала по сравнениюс вариантом, в котором облучение осуществляли только жестким УФ излучением С-типа(рисунок 22).
Частота мутагенеза, индуцированного жестким УФ излучением, последополнительного облучения с длинной волны 365 нм снижалась незначительно.Повышение дозы облучения, использованного для фотореактивации, приводило кувеличению частоты мутагенеза и не влияло на выживаемость.69Рисунок 22. Выживаемость клеток дрожжей на фоне воздействия УФ излучения 254 нм,излучения 365 нм и последовательного облучения УФ с длинами волны 254 нм и 365 нм,выраженная в процентах относительно случая без воздействия.Примечание: * – Значения выживаемости по критерию Вилкоксона (Р<0,05) достоверноотличаются от значения выживаемости клеток, облученных УФ излучением 254 нм.Таким образом, для изучения эффекта фотореактивации в альфа-тесте былаподобрана такая доза излучения (36000 Дж/м2) с длинной волны 365 нм, при которой непроисходило значительное повышение частоты мутирования и наблюдалось повышениевыживаемости клеток, облученных совместно жестким УФ излучением (254 нм) и УФизлучением (365 нм).Мы показали, что в альфа-тесте фотореактивация на фоне воздействия УФизлучения приводит к незначительному (в 1,3 раза) снижению частоты "незаконной"гибридизации, за счет снижения частоты всех классов учитываемых событий (рисунок 23.А) и не изменяет частоту "незаконной" цитодукции (рисунок 23.
Б) (приложение М-Н). Вальфа-тесте излучение с длинной волны 365 нм, использованное для индукциифотореактивации, обладает собственным незначительным мутагенным эффектом иповышает частоту "незаконной" гибридизации (рисунок 23. А). Эти данные согласуются срезультатами теста на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину.70Рисунок 23. Влияние фотореактивации на спонтанную и индуцированную частоту (A)"незаконной" гибридизации и (Б) "незаконной" цитодукции.Примечание:* – Значения частоты по критерию Вилкоксона (Р<0,05) достоверноотличается от частоты, тех же событий, возникших спонтанно;** – Значения частоты по критерию Вилкоксона (Р<0,05) достоверно отличаются отчастоты тех же событий, индуцированных УФ излучением (254 нм).Мы предполагаем, что мутагенный эффект УФ излучения с длинной волны 365 нмопосредован окислительными повреждениями, которые часто возникают под действиемдлинноволнового УФ излучения.
Мутагенный эффект излучения с длиной волны 365 нмпрепятствуетизучениюфотореактивациивальфа-тесте,посколькуонможеткомпенсировать ожидаемое снижение частоты мутирования, возникающее при активностифотолиазы, устраняющей циклобутановые димеры. Именно с этим может быть связанонаблюдавшееся незначительное понижение частоты мутирования после фотореактивациив клетках, облученных жестким УФ излучением. Другое возможное объяснениенаблюдавшихся эффектов может быть связано с тем, что фотореактивация уиспользованныхштаммовдрожжейявляетсяминорнымпутемустраненияпиримидиновых димеров, тогда как основную их долю устраняют белки эксцизионнойрепарации нуклеотидов.71Таким образом, с помощью альфа-теста можно выявить фенотипическоепроявление первичных повреждений (циклобутановых димеров и 6-4-фотопродуктов).Жесткое УФ излучение (254 нм) индуцирует частоту временных повреждений в среднем в10-14 раз (приложение Н).
Тем не менее, сочетание УФ облучения с последующейфотореактивациейнепозволиланамизолироватьсобственноефенотипическоепроявление пиримидиновых димеров в альфа-тесте.3.4. Исследование фенотипического проявления двунитевых разрывов ДНК всистемах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукцииС целью изучения возможности фенотипического проявления двунитевыхразрывов мы исследовали в альфа-тесте эффект ингибитора ДНК-топоизомеразы I –камптотецина.В ходе репликации, транскрипции и структурной реорганизации хроматина в ДНКпри расплетении двух комплементарных цепей возникает суперспирализация, которуюустраняет топоизомераза I. Топоизомераза I вносит однонитевой разрыв в ДНК, чтопозволяет спирали ДНК вращаться вокруг интактной цепи и снимает излишнеенапряжение ДНК.
После релаксации топоизомераза I соединяет разорванные концы(рисунок 24) [161].72Рисунок 24. Функция топоизомеразы I [161].КамптотецинковалентносвязываетсястопоизомеразойIиДНК.Этопредотвращает лигирование ДНК, приводит к блоку вилки репликации и накоплениюдвунитевых разрывов ДНК, возникающих вследствие нескольких последовательныхреакций.
На первом этапе происходит вырезание комплекса топоизомеразы I икамптотецина с образованием однонитевых разрывов, препятствующих продвижениюДНК-полимеразы. Остановка синтеза ДНК напротив однонитевого разрыва приводит кпоявлению двунитевых разрывов (рисунок 25.А) [161-163]. Камптотецин также приводитк остановке РНК-полимеразы и блоку элонгации транскрипции, при этом накапливаетсянегативная суперспирализация ДНК, индуцирующая формирование R-петель, которыестимулируют возникновение двунитевых разрывов (рисунок 25.Б) [161, 162, 164].Камптотецин блокирует синтез как ДНК, так и РНК, но он наиболее токсичен в стадии Sклеточного цикла [165].73Рисунок 25.
Возникновение двунитевых разрывов в ходе репликации (А) итранскрипции (Б) при связывании камптотецина с топоизомеразой I [161, 164].Мы показали, что в присутствие камптотецина частота "незаконной" гибридизациивозрастает примерно в 38 раз (рисунок 26). Анализ спектра индуцированныхкамптотецином "незаконных" гибридов показал, что ингибитор топоизомеразы Iсущественно индуцирует все события, учитываемые в тесте на "незаконную"гибридизацию, – потерю хромосомы III (в 36 раз) и ее правого плеча (в 47 раз),рекомбинацию (в 29 раз) и конверсию (в 5 раз), а также учитываемые совместно генныемутации и временные повреждения (в 33 раз) (рисунок 26) (приложение П).74Рисунок 26.
Частота "незаконной" гибридизации, наследуемых и ненаследуемыхизменений генетического материала, возникших при воздействии камптотецином испонтанно.ОЧГ – общая частота "незаконной" гибридизацииПХ – Потеря хромосомы IIIППХ – Потеря правого плеча хромосомы IIIМВП – Мутации и временные повреждения в локусе MATαРек – Реципрокная рекомбинация между локусом МАТα и кассетой HMRaКонв – Конверсия кассеты HMRa в локус MATα* – Значения достоверно по критерию Манна-Уитни (Р<0,05) отличаются от значений техже событий, возникших спонтанно.Камптотецин повышает частоту "незаконной" цитодукции в 6 раз, это повышениепроисходит за счет возрастание частоты цитодуктантов, у которых после скрещиванияпроизошло безошибочное устранение первичного повреждения генетического материала(рисунок 27). При воздействии камптотецином доля класса временных поврежденийвозрастает по сравнению со спонтанным уровнем (рисунок 28) (приложение Р).75Рисунок 27.
Частота "незаконной" цитодукции и частота класса временных повреждений,возникших спонтанно и при воздействии камптотецином.Рисунок 28. Доля классов генетических событий, выявляемых в тесте на "незаконную"цитодукцию, возникших (А) спонтанно и (Б) при воздействии камптотецина.В тесте на "незаконную" цитодукцию невозможно выявить такие события, какпотеря хромосомы III, потеря правого плеча хромосомы III и рекомбинация, а именно этигенетические события наиболее сильно индуцирует камптотецин, как следует изрезультатов теста на "незаконную" гибридизацию. Возможно, это является одной из76причин того, что камптотецин сильнее повышает частоту "незаконной" гибридизации, чемчастоту "незаконной" цитодукции.Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, чтодвунитевыеразрывы,индуцированныевременномупереключениютипакамптотецином,спариванияα→способныа,т.е.могутприводитькпроявлятьсяфенотипически.3.5.
Изучение природы "незаконных" гибридов, потерявших хромосому IIIОдним из наиболее частых генетических событий, учитываемых в альфа-тестеявляется потеря хромосомы III. Доля гибридов, лишенных хромосомы III, от общего числа"незаконных" гибридов, возникающих спонтанно или под действием генотоксическихвоздействий, составляет от 30 до 50 % [16, 17, 82].
Наши данные о частоте потерихромосомы III, полученные с использованием альфа-теста, согласуются с литературнымиданными. Ранее в тест-системе, аналогичной используемому нами альфа-тесту, такжебыло показано, что потеря хромосомы III является наиболее частым событием,приводящем к потере локуса MATα и, как следствие, к возникновению "незаконных"гибридов [124, 125]. Остается открытым вопрос о том, на каком этапе (до или послеформирования "незаконного" гибрида) происходит потеря хромосомы III, и может ликлетка, потерявшая хромосому, вступать в гибридизацию. Ответ на вопрос опроисхождении "незаконных" гибридов, лишенных хромосомы III, важен для адекватнойинтерпретации результатов альфа-теста. Можно представить два возможных механизмаих появления.
Первый механизм возникновения "незаконных" гибридов, лишенных IIIхромосомы, состоит в следующем. Возникновение спонтанного или индуцированногогенотоксическим воздействием первичного повреждения в локусе МАТα нарушает егоэкспрессию. Это приводит к временному переключению типа спаривания α→а. Клетка,сменившая тип спаривания на противоположный вступает в скрещивание, что приводит кформированию "незаконного" гибрида, несущего интактную хромосому III и хромосомуIII с повреждением в локусе MATα. Последующая репарация поврежденной ДНК можетприводить к потере хромосомы III и закреплению повреждения в виде наследуемогоизменения. В этом случае гибриды без хромосомы III появляются в результатенетождественнойрепарациипервичныхповрежденийДНКлокусаMATпослегибридизации (рисунок 28. А). Второй возможный механизм возникновения "незаконных"гибридов без хромосомы III можно описать следующим образом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
