Диссертация (1145828), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Вотличие от 8-ОГ, ни одна из систем репарации не узнает ГАП у дрожжей [148], что такжеможет сказываться на разнице в индукции частоты "незаконной" гибридизации ицитодукции двумя аналогами оснований 8-ОГ и ГАП. В связи с этим требует объяснениямеханизм устранения первичного повреждения, индуцированного включением ГАП вДНК, и возникновения "незаконных" цитодуктантов типа спаривания α без привлечениясистем репарации. Это легко представить, имея в виду то, что ГАП не блокируетматричный синтез ДНК, а лишь вызывает замены оснований, поскольку он можетобразовывать пары не только с тимином, но и с цитозином. При инкубации клетокдрожжей на среде с ГАП, он включается в ДНК.
Если ГАП появляется в локусе МАТα, этоможет привести к временному переключению типа спаривания и формированию"незаконного" гибрида или цитодуктанта. После скрещивания дрожжевых клеток ГАПбольше не встраивается в ДНК, поскольку он отсутствует в среде для отбора«незаконных» гибридов и цитодуктантов.
Таким образом, количество клеток с ГАП вДНК уменьшается с каждым делением. При делении клетки, возникшей в результате"незаконного" скрещивания и содержащей ГАП в ДНК, появляются две дочерние клетки:одна из них содержит ГАП в ДНК, а вторая получает аллель, возникшую при репликациина матрице с ГАП, которая может быть либо мутантной, либо исходной в зависимости оттого, какой нуклеотид был подставлен при репликации напротив ГАП. В случае с ГАП непроисходит того, что принято называть репарацией, т.е. никакие системы не вырезаютповреждение с последующим восстановлением исходной последовательности ДНК.63Восстановление структуры ДНК происходит при переходе от родительской к дочернейклетке. В данном случае устранение повреждения растянуто на 2-3 клеточных деления, итакже как при репарации, его точность определяется неоднозначностью матричногосинтеза ДНК на поврежденной матрице.Таким образом, в данной работе мы показали, что модификации оснований,индуцированные аналогами оснований ГАП и 8-ОГ, повышают частоту временныхповреждений, учитываемых в альфа-тесте (рисунок 15, рисунок 18), что свидетельствует отом, что модификации оснований могут самостоятельно проявляться фенопипически.
Приэтом большая доля первичных повреждений, индуцированных аналогами оснований,учитывается в альфа-тесте как временные повреждения, а оставшаяся часть первичныхповреждений в ходе нетождественной репарации превращается в точечные мутации(приложение А-Д). Наши результаты согласуются с литературными данными о том, чтоГАП и 8-ОГ индуцируют точечные мутации [150, 153].3.2. Влияние инактивации репарации ДНК с неспаренными основаниями на частотунаследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала, выявляемых всистемах "незаконной" гибридизации и "незаконной" цитодукцииДля определения возможности фенотипического проявления неспаренностейоснований мы изучили в альфа-тесте эффект инактивации гена PMS1, кодирующего одиниз основных белков системы репарации ДНК с неспаренными основаниями (MMR –mismatch repair).Система репарации ДНК с неспаренными основаниями играет ключевую роль вподдержании стабильности генома.
Субстратом белков MMR являются неканоническиепары между нормальными или модифицированными основаниями. MMR работает впоздней S и ранней стадий G1. Главным образом неканонические пары основанийвозникают в результате ошибок репликации, когда ДНК-полимераза ошибочноподставляет неправильные нуклеотиды. Кроме того, неспаренности могут появляться и входе метилирования, окислительных повреждений ДНК и рекомбинации [156].
БелкиMMR узнают неспаренности и вырезают участок вновь синтезированной цепи ДНК,несущий неспаренность. Образовавшуюся однонитевую брешь застраивает репликативнаяДНК-полимераза. Принципиальное отличие MMR от других систем репарации состоит втом, что в ходе MMR происходит репарация новой цепи по той цепи ДНК, котораяслужила матрицей в ходе репликации. Репарация ДНК с неспаренными основаниямивысоко консервативная система, MMR была описана как у прокариот, так и у эукариот.
У64Е.coli репарацию ДНК с неспаренными основаниями осуществляют три белка-гомодимераMutS, MutL и MutH [157]. У S. cerevisiae обнаружено 6 гомологов MutS, кодируемыхгенами MSH1-MSH6 и 4 гомолога MutL, кодируемых генами MLH1-MLH3 и PMS1 [157].Первым гомологом MutL, идентифицированным у дрожжей, стал Pms1. Его названиеотражает тот факт, что у мутантов pms1 повышен уровень пост-мейтотической сегрегации[157].
У дрожжей белок, кодируемый геном PMS1, является компонентом гетеродимераMutLα (Mlh1-Pms1), который играет ключевую роль в осуществлении репарации ДНК снеспаренными основаниями. Этот комплекс вносит разрез с 3' или 5' стороны отнеспаренного нуклеотида на вновь синтезированной цепи ДНК. Этот участок ДНКвырезает экзонуклеаза Exo1, совместно с репликативным белком A. Однонитевую брешьзастраивает ДНК-полимераза δ и лигирует ДНК-лигаза 1 [156]. У мутантов по гену PMS1происходит накопление неспаренностей оснований в ДНК и как следствие повышениечастоты замен нуклеотидов.Мы показали, что в тесте на "незаконную" гибридизацию делеция гена PMS1повышает общую частоту "незаконной" гибридизации в 4 раза и индуцирует потерюхромосомы III, ее правого плеча, совместно учитываемых генных мутаций и временныхповреждений, рекомбинацию, и не влияет на частоту конверсии (рисунок 19) (приложениеЖ).Рисунок 19.
Частота "незаконной" гибридизации, наследуемых и ненаследуемыхизменений генетического материала у штаммов дикого типа wt и с мутацией pms1.Примечание:65ОЧГ – общая частота "незаконной" гибридизацииПХ – Потеря хромосомы IIIППХ – Потеря правого плеча хромосомы IIIМВП – Мутации и временные повреждения в локусе MATαРек – Реципрокная рекомбинация между локусом МАТα и кассетой HMRaКонв - Конверсия кассеты HMRa в локус MATα* – Значения частоты достоверно отличаются по критерию Манна-Уитни (Р<0,05) отчастоты тех же событий, возникших у штамма дикого типа.Инактивация MMR не приводит к изменению частоты "незаконной" цитодукции. Всистеме "незаконной" цитодукции у мутанта pms1 достоверно снижается частотавременных повреждений и повышается частота мутаций одновременно в MATα1 и MATα2в 8 раза, частота мутаций MATα1 или MATα2 в 10 раз (рисунок 20) (приложение К).Рисунок 20.
Частота "незаконной" цитодукции, наследуемых и ненаследуемых измененийгенетического материала у штаммов дикого типа wt и с мутацией pms1.Примечание:OЧЦ – Общая частота цитодукцииВП – Временные повреждения в локусе MATα (одновременно в MATα1 и MATα2,или вдвустороннем промоторе)66Конв – Конверсия кассеты HMRa в локус MATαМут а* – Мутации одновременно в MATα1 и MATα2,или в двустороннем промоторе,делеции МАТα)Мут n/m – Мутации в MATα1 или MATα2* – Значения частоты достоверно отличаются по критерию Манна-Уитни (Р<0,05)отчастоты тех же событий, возникших у штамма дикого типа.Доля временных повреждений у штамма pms1 также снижается, а доля мутаций вобщем числе учитываемых событий возрастает по сравнению со штаммом дикого типа(рисунок 21).Рисунок 21.
Распределение классов генетических событий, выявляемых в тесте на"незаконную" цитодукцию, в процентом соотношении, возникших (А) у штамма дикоготипа и (Б) с мутанта pms1.Примечание: Подчеркиванием отмечено достоверное изменение соотношение доли классагенетических событий у мутанта pms1 по сравнению с соответствующей долей у штаммадикого типа по z-критерию (Р<0,05).Изучение эффекта инактивации MMR в альфа-тесте показало, что неспаренностиоснований, накопление которых происходит на фоне делеции гена PMS1, повышаетчастоту "незаконного" скрещивания.
Возрастание частоты "незаконной" гибридизации67происходит исключительно за счет наследуемых генетических изменений. Отсутствиеиндукции частоты временных повреждений у мутанта pms1 указывает на то, чтонеспаренности оснований не имеют собственного фенотипического проявления в альфатесте. Это согласуется с литературными данными. Большинство неспаренностейоснований возникает из-за ошибок ДНК полимераз в ходе репликации, чаще всегонеспаренности возникают между нормальными основаниями ДНК.
Если неканоническоеоснование появляется в кодирующей цепи, то оно может проявиться как мутация, если внекодирующей, то такое повреждение никак не проявится [156, 157].3.3. Изучение способности пиримидиновых димеров проявляться фенотипически вальфа-тестеРанее мы показали, что ультрафиолетовое излучение является эффективныминдуктором "незаконной" гибридизации и цитодукции и приводит к многократномуповышению частоты всех событий, учитываемых в альфа-тесте, в том числе, первичныхповреждений [16, 17, 82, 158]. Под действием УФ излучения в ДНК возникаютциклобутановыепиримидиновыедимеры,6-4фотопродуктыиокислительныеповреждения азотистых оснований, которые в процессе репарации могут превращаться вапуриновыесайты,одно-идвунитевыеразрывы[64,76].Циклобутановыепиримидиновые димеры составляют около 80% от всех повреждений, индуцируемых УФизлучением [159, 160]. Поскольку УФ излучение приводит к возникновению различныхповреждений, способных превращаться в повреждения других типов, невозможноустановить, фенотипическое проявление каких именно повреждений мы наблюдаем вальфа-тесте.
Поэтому для того, чтобы изучить фенотипическое проявление первичныхповреждений одного определенного типа, а именно пиримидиновых димеров, мыисследовали в альфа-тесте эффект последовательного облучения УФ светом (254 нм) споследующей фотореактивацией. Повреждения, индуцированные УФ излучением,устраняет эксцизионная репарация нуклеотидов, или фотореактивация, обнаруженная унекоторых микроорганизмов [76]. Реакцию фотореактивации осуществляет ферментфотолиаза. Фотолиаза узнает повреждение и преобразует энергию света с длиной волны365 нм в химическую, в результате происходит разрыв ковалентной связи между двумянуклеотидами и структура ДНК восстанавливается [64, 76].
Существует два типафотолиаз: ферменты первого типа узнают пиримидиновые димеры, субстратом ферментоввторого типа являются 6-4-фотопродукты [159]. У дрожжей только пиримидиновыедимеры могут быть устранены посредством фотореактивации [64]. Мы ожидали, что68использованиефотореактивацииприпроведенииальфа-тестапозволитоценитьвозможность фенотипического проявления именно пиримидиновых димеров.Эксперименты проводили следующим образом: клетки тестерного штамма К5-35Д924 высевали на твердую полную и селективную среды, клетки подвергали воздействиюУФ излучения С-типа с длиной волны 264 нм для индукции циклобутановых димеров.Затем в опытном варианте чашки облучали УФ излучением А-типа с длинной волны 365нм для осуществления фотореактивации. Полученные результаты сравнивали соследующими контрольными вариантами: без облучения, облучение только жестким УФизлучением С-типа и облучение только УФ излучением А-типа (см раздел "материалы иметоды").На первом этапе исследования для того, чтобы подобрать оптимальную дозу УФизлученияА-типасдлиннойволны365нм,достаточнуюдляэффективнойфотореактивации мы провели тест на индукцию прямых мутаций устойчивости кканаванину.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
