Диссертация (1145828), страница 11
Текст из файла (страница 11)
РезультатыДля того чтобы определить молекулярную природу первичных повреждений ДНК,способных проявляться фенотипически, мы исследовали влияние эталонных мутагенов,вызывающих повреждения определенного типа, и дефектов различных систем репарациина спектр изменений генетического материала, приводящих к переключению типаспаривания α → а у дрожжей S. cerevisiae. О факте временного или наследуемогопереключения типа спаривания α→а судили по возникновению "незаконных" гибридов ицитодуктантов при скрещивании двух штаммов α типа спаривания в селективныхусловиях. В работе мы учитывали события, возникающие в альфа-тесте, двумя способами.Во-первых, определяли общую частоту "незаконной" гибридизации или цитодукции,представляющую собой отношение числа "незаконных" гибридов или цитодуктантов,соответственно, к числу выживших клеток.
Во-вторых, определяли долю каждого классаот числа проверенных "незаконных" гибридов или цитодуктантов и частоту каждогокласса. Мы определяли соотношение наследуемых и ненаследуемых изменений,наблюдаемое при воздействии генотоксических факторов по сравнению с контрольнымвариантом без обработки мутагенами. На основе полученных результатов делали выводыо способности первичных повреждений проявляться фенотипически.3.1. Исследование фенотипического проявления модификаций оснований ДНК,индуцированных аналогами оснований, в системах "незаконной" гибридизации и"незаконной" цитодукцииВозможность фенотипического проявления модификаций оснований в альфа-тестеизучали на примере двух аналогов оснований ГАП и 8-ОГ.3.1.1. Влияние 6-N-гидроксиламинопурина на частоту наследуемых и ненаследуемыхповреждений ДНКГАП – аналог аденина, который в форме нуклеотида встраивается в ДНК прирепликации напротив тимина или цитозина (рисунок 11).
Показано, что у дрожжей ниодна из систем репарации не способна узнавать и удалять ГАП из ДНК [148]. Поэтому удрожжей, в отличие от E. сoli и человека, ГАП не способен индуцировать рекомбинациюи появление однонитевых или двунитевых разрывов ДНК, которые часто возникают входе репарации. Будучи встроенным в ДНК, ГАП у дрожжей индуцирует исключительногенные мутации типа транзиций GC → АТ или AT → GC [148-150]. В связи с этимисвойствами мы выбрали ГАП в качестве эталонного мутагена для изучения способности55модификаций оснований проявляться фенотипически в альфа-тесте. Клетки обрабатывалиГАП в растущей культуре в полной среде, содержащей ГАП в концентрации 50 мг/л.
Ваналогичных условиях ГАП повышает частоту мутаций устойчивости к канаванину удрожжей приблизительно на два порядка [151, 152].Рисунок 11. Включение ГАП в ДНК при репликации и механизм возникновения генныхмутаций (транзиций): А) замен GC → АТ; Б) замен AT → GC [150].Мы показали, что в альфа-тесте ГАП повышает общую частоту "незаконной"гибридизации в 5 раз (рисунок 12).
Повышение частоты "незаконной" гибридизации вприсутствии ГАП происходит в основном за счет индукции генных мутаций и временныхповреждений, учитываемых совместно, и в меньшей мере за счет повышения частотыпотери хромосомы III (приложение А, Б). Мы наблюдали, что в присутствие ГАПпроисходит небольшое (в 2 раза) снижение частоты рекомбинации, а влияние этогоаналога на частоту генной конверсии не было обнаружено (рисунок 13) (приложение Б).56Рисунок 12.
Частота спонтанной и индуцированной ГАП "незаконной" гибридизации,потери хромосомы III, потери правого плеча хромосомы III, мутаций и временныхповреждений.Примечание:ОЧГ – общая частота "незаконной" гибридизацииПХ – Потеря хромосомы IIIППХ – Потеря правого плеча хромосомы IIIМВП – Мутации и временные повреждения в локусе MATα* – Значения достоверно отличаются от частоты тех же событий, возникающих спонтанно,по критерию Манна-Уитни (Р<0,05).Рисунок 13. Частоты спонтанной и индуцированной ГАП рекомбинации и конверсииПримечание:57Рек – Реципрокная рекомбинация между локусом МАТα и кассетой HMRaКонв – Конверсия кассеты HMRa в локус MATα* – Значения достоверно отличаются частоты тех же событий, возникающих спонтанно,по критерию Манна-Уитни (Р<0,05).Анализ соотношения классов "незаконных" гибридов показал, что под действиемГАП снижается доля потери хромосомы III, ее правого плеча, и значительно возрастаетдоля класса, учитывающего совместно мутации и временные повреждения (рисунок 14).Рисунок 14.
Процентное соотношение классов генетических событий, выявляемых в тестена "незаконную" гибридизацию, возникших: (А) спонтанно и (Б) при воздействии ГАП.Примечание: Подчеркиванием отмечено достоверное изменение доли соответствующегокласса генетических событий после обработки ГАП по сравнению со спонтанным уровнемпо z-критерию (Р<0,05).Для того чтобы определить отдельно значения частоты генных мутаций ивременных повреждений, индуцируемых ГАП, мы провели тест на "незаконную"цитодукцию (приложение В). Мы показали, что ГАП повышает общую частоту"незаконной" цитодукции в 10 раз, а частоту временных повреждений в 11 раз (рисунок5815).
Тест на "незаконную" цитодукцию позволяет выявлять 2 типа генных мутаций:мутации, нарушающие экспрессию одновременно MATα1 и MATα2 и мутации,затрагивающие только один из генов MATα1 или MATα2. Обработка клеток ГАП приводитк повышению частоты обоих типов наследуемых изменений по сравнению со спонтаннымуровнем (рисунок 15).Рисунок 15. Частота спонтанной и индуцированной ГАП "незаконной" цитодукции инаследуемых и ненаследуемых изменений генетического материала.Примечание:OЧЦ – Общая частота цитодукции;ВП – Временные повреждения в локусе MATα (одновременно в MATα1 и MATα2,или вдвустороннем промоторе);Конв – Конверсия кассеты HMRa в локус MATα;Мут а* – Мутации одновременно в MATα1 и MATα2, или в двустороннем промоторе,делеции МАТα)Мут n/m – Мутации в MATα1 или MATα2* – Значения достоверно отличаются частоты тех же событий, возникающих спонтанно,по критерию Манна-Уитни (Р<0,05).Основной вклад в повышение частоты "незаконной" цитодукции под действиемГАП вносят временные повреждения.
Мы наблюдали не только возрастание частотывременных повреждений при действии ГАП, но увеличение их доли по сравнению со59спонтанным уровнем (рисунок 16). Именно этот класс выявляемых событий позволяетоценивать фенотипическое проявление первичных повреждений еще до репарации ДНК сэтими повреждениями, в данном случае модификаций оснований. У цитодуктантов этогокласса первичное повреждение временно нарушает экспрессию локуса MATα, а послескрещивания клетки восстанавливают исходный фенотип α.Рисунок 16. Распределение классов генетических событий, выявляемых в тесте на"незаконную" цитодукцию, в процентом соотношении, возникших (А) спонтанно и (Б)при воздействии ГАП.Примечание: Подчеркиванием отмечено достоверное изменение соотношение доли классагенетических событий после обработки ГАП по сравнению с соответствующей долейспонтанных событий по z-критерию (Р<0,05).Таким образом, на основе наших экспериментальных данных можно сделать выводо том, что модификации азотистых оснований ДНК могут самостоятельно проявлятьсяфенотипически в альфа-тесте еще до их устранения системами репарации.603.1.2.
Влияние накопления эндогенного 8-окcогуанина на частоту наследуемых иненаследуемых изменений генетического материала8-ОГ образуется в результате окисления гуанина активными формами кислорода,как непосредственно в ДНК, так и в пуле нуклеотидов [134]. При репликации 8-ОГ можетобразовывать пары не только с цитозином, но и с аденином, что приводит к транзверсиямGC → TA.
Основным путем репарации ДНК с 8-ОГ является эксцизионная репарацияоснований [153]. 8-ОГ узнает и вырезает из ДНК специфическая ДНК-гликозилаза,кодируемая геном OGG1. У мутантов по гену OGG1 происходит накопление эндогенного8-ОГ в ДНК (рисунок 17) [153]. Поэтому для того, чтобы изучить возможностьфенотипического проявления 8-ОГ в альфа-тесте мы использовали штаммы дрожжей,несущие делецию гена OGG1, у которых не происходит вырезание модифицированногооснования из ДНК. Известно, что у мутантов дрожжей по гену OGG1 в тесте на индукциюпрямых мутаций устойчивости к канаванину частота мутаций повышается в 3-5 раз [153155]. Поэтому мы ожидали, что эффект инактивации гена OGG1 в альфа-тесте будетменее выражен, чем в случае использования ГАП, который в концентрации 50 мг/млиндуцирует мутагенез в 180-400 раз в той же тест-системе [151, 152].Рисунок 17.
Репликация ДНК с 8-ОГ и механизм возникновения генных мутаций(транзиций).Мы показали, что мутация ogg1 не приводит к изменению частоты "незаконной"гибридизации, незначительно понижает частоту рекомбинации и конверсии (приложение61Г). У мутантов по гену OGG1 наблюдается трехкратное возрастание частоты "незаконной"цитодукции (рисунок 18), что соответствует нашим ожиданиям, основанным налитературных данных.
Частота временных повреждений у мутантов ogg1 возрастает в 3,5раза, частота мутаций одновременно в MATα1 и MATα2 в 3,7 раза, частота мутаций MATα1или MATα2 в 62 раза (рисунок 18) (приложение Д).На основе полученных данных можно сделать вывод о том, что модификацииоснований, возникающие на фоне инактивации гена OGG1, могут проявлятьсяфенотипически в альфа-тесте.Рисунок 18. Частота "незаконной" цитодукции, наследуемых и ненаследуемых измененийгенетического материала у штаммов дикого типа (wt) и с мутацией ogg1.Примечание: * – Значения достоверно отличаются по критерию Манна-Уитни (Р<0,05) отзначения частоты тех же событий, возникших спонтанно.62Мы полагаем, что отсутствие индукции "незаконной" гибридизации и наличиеожидаемого эффекта в тесте на "незаконную" цитодукцию связано с тем, что в тесте на"незаконную"гибридизациюосновнуюдолю учитываемыхсобытийсоставляютхромосомные нарушения, частота которых не возрастает у мутантов ogg1, но, вероятно,маскирует небольшое возрастание частоты более редкого класса "мутации и временныеповреждения".
Поскольку мутация ogg1 является относительно слабым мутатором, ееэффект удалось зафиксировать в тесте на "незаконную" цитодукцию, в котором из учетаисключены такие генетические события, как потеря хромосомы III, ее правого плеча ирекомбинация. Различия эффектов двух аналогов оснований ГАП и 8-ОГ, наблюдаемые вальфа-тесте, могут быть связаны еще и с их различной способностью индуцироватьрепарацию. На фоне отсутствия ДНК-гликозилазы, контролирующей основной путьрепарации ДНК с 8-ОГ, эндогенный 8-ОГ может устраняться посредством белковэксцизионной репарации нуклеотидов и репарации ДНК с неспаренными основаниями. Впоследнем случае комплекс белков Msh2/Msh6/Mlh1 вырезает аденин, неправильноподставленный напротив 8-ОГ ДНК-полимеразой δ или ДНК-полимеразой η [153, 155].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
