Диссертация (1145828), страница 7
Текст из файла (страница 7)
В стадии S происходит синтез ДНК иначинается формирование почки, которая увеличивается по мере прохождения стадии G2и к стадии М достигает размера чуть меньше материнской клетки, ядро мигрирует вмежклеточную перетяжку и осуществляется митоз (рисунок 5) [83, 91].Рисунок 5. Клеточный цикл гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae.При прохождении клетки через клеточный цикл осуществляется контроль этогопроцесса в контрольных точках (checkpoint). В стадии G1 до точки "старта"осуществляется контроль наличия повреждений ДНК и размеров клетки. В стадии S30наряду с повреждениями ДНК проверяется точность и завершенность репликации.
Встадии G2/М оценивается целостность и количество хромосом, точность расхожденияхромосом в митозе [92-95]. Если обнаруживаются какое-либо из нарушений, топроисходит остановка клеточного цикла, при этом либо нарушение устраняется, либоклетка гибнет.1.6.1.2. Генетический контроль типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeКлеточный тип дрожжевой клетки контролируется локусом типа спаривания MAT,расположенным в правом плече хромосомы III на расстоянии около 100 тысяч п.
о. отцентромеры и теломеры [83, 96-98]. В локусе МАТ находится один из двух идиоморфовМАТа или МАТα, определяющих типы спаривания а и α соответственно. Длина МАТα иМАТа различается на 700 п. о. Идиоморфы MATα и MATа кодируют транскрипционныефакторы, контролирующие экспрессию ряда генов, специфичных для каждого клеточноготипа. В клетках α типа спаривания экспрессируются только α-специфичные гены (αsg), а вклетках а типа спаривания – только а-специфичные гены (asg) [83, 99, 100].
В диплоидахМАТα/МАТа подавлены гаплоид-специфичные гены, но работают диплоид-специфичныегены, необходимые для споруляции (рисунок 6).В идиоморфе МАТα найдено две группы комплементации МАТα1 и МАТα2,которые находятся под контролем общего двустороннего промотора, транскрипция этихгенов происходит в противоположных направлениях (рисунок 6) [100, 101]. Продукт генаМАТα1 совместно с конститутивно экспрессируемым белком Mcm1, индуцируеттранскрипцию αsg-специфичных генов, включая те, которые кодируют α-фактор (MFα1 иMFα2) и Ste3, который является транс-мембранным рецептором к а-фактору [102].Продукт гена МАТα2 совместно с белком Mcm1 является негативным регулятором asgспецифичных генов, включая гены, которые кодируют а-фактор (MFа1, MFa2), Ste2(транс-мембранный рецептор α-фактора), ген STE6 (вовлечен в биогенез а-фактора, атакже BAR1 (кодирует белок, способный разрушать α-фактор) [103].
Локус МАТа такжекодирует два транскрипта MATa1 и MATa2, однако в регуляции типа спаривания угаплоидов они не участвуют. Гены asg экспрессируюся конститутивно (рисунок 6) [83,99]. Третий клеточный тип а/α, возникающий при скрещивании гаплоидных клетокпротивоположных типов спаривания, определяется сложным взаимодействием МАТа иМАТα. У диплоидов продукты генов MATa1 и MATα2 подавляют транскрипцию MATα1 игаплоид-специфичных генов, но не нарушают транскрипцию MATα2, вследствии чегодиплоиды стерильны [83].31Мутации в одном из двух генов идиоморфа МАТα приводят к тому, что клеткидрожжей становятся стерильными и теряют способность к скрещиванию [104, 105]. Этопроисходит по тому, что при нарушении экспрессии гена МАТα1 не работают ни αsg, ниаsg, а при отсутствии продукта гена МАТα2 одновременно экспрессируются αsg и аsg.Мутации, возникающие в обоих генах МАТα1 и МАТα2 или в двустороннем промотореприводят к тому, что клетка меняет тип спаривания α → а и проявляет рецессивный а-типспаривания, именуемый Alf-фенотип и обозначаемый а*.
Такие гаплоидные клеткиприобретают фенотип а и способность скрещиваться с клетками α типа спаривания,поскольку в этом случае а-специфичные гены экспрессируются конститутивно на фонеотсутствия их репрессора MATα2, и α-специфичные гены не транскрибируются попричине отсутствия их активатора MATα1 [100].Рисунок 6. Регуляция экспрессии генов asg, αsg и hsg в клетках а, α и а/α типов спариванияпо [83, 100].1.6.1.3. Переключение типов спаривания у дрожжей Saccharomyces cerevisiaeВ хромосоме III помимо локуса МАТ расположены еще два локуса – HMRа иHMLα, которые содержат неэкспрессируемую генетическую информацию о типе32спаривания а и α, соответственно [106, 107].
Наличие этих кассет позволяет дрожжевойклетке менять свой тип спаривания на противоположный благодаря транспозициинеэкспрессирующейся информации из локусов HMRа или HMLα в локус МАТ, где онаэкспрессируется. При этом исходная информация в локусе МАТ теряется [108].Подавление экспрессии кассет осуществляется продуктами 5 генов SIR1, SIR2, SIR3, SIR4(от англ. silent information regulator), и гена RAP1. Для инактивации кассет HML и HMRтакже необходимо наличие специфичных сайтов-сайленсеров E (essential) и I (important), скоторыми взаимодействуют продукты генов SIR [97, 109-111]. Сайты по левую сторонукассеты называют Е-сайленсерами, сайты по правую сторону называют I-сайленсерами.Сайленсеры, представляющие собой участки ДНК (менее 150 п.
о.), располагаются болеечем за тысячу пар нуклеотидов от промоторов регулируемых ими генов.У гомоталличных штаммов переключение типа спаривания может происходить угаплоидных материнских клеток в каждом клеточном делении. Диплоидная клеткагомоталличного штамма продуцирует четыре аскоспоры по две каждого типа спаривания(2 а и 2 α). При первом митотическом делении аскоспора продуцирует две клетки –материнскую и дочернюю одинакового типа спаривания. Во время второго митотическогоделения в поздней стадии G1 клеточного цикла в материнской клетке происходитпереключение типа спаривания на противоположный, при этом дочерняя клетка делитсябез изменения типа спаривания.
Таким образом, из одной аскоспоры образуется четыреклетки, по две разных типов спаривания. Эти клетки копулируют друг с другом, врезультате чего образуются диплоидные гибриды, поэтому гаплоидная стадия угомоталличных штаммов кратковременна [112]. Переключение типов спаривания напротивоположныйугомоталличныхштаммовпроисходитпомеханизмуоднонаправленной конверсии между одной из молчащих кассет и локусом МАТ благодаряактивности специфичной эндонуклеазы, кодируемой геном HO [108, 113]. ЭндонуклеазаHо вносит двунитевой разрыв в специфическом сайте в локусе МАТ. Этот разрывустраняется с использованием гомологичной последовательности в одной из кассет, темсамым инициируя процесс переключения типа спаривания [114, 115]. Механизмспецифического сближения МАТ и кассет HMRа или HMLα неизвестен.
Эндонуклеаза Hoработает исключительно в материнской гаплоидной клетке на стадии G1 клеточногоцикла [116].Гетероталличныештаммынесутрецессивнуюнеактивнуюаллельho.Переключение типа спаривания у таких штаммов происходит с низкой частотой (10-6),которая повышается при воздействии агентов, повреждающих ДНК, таких как33рентгеновское и ультрафиолетовое излучения и другие мутагены [117-119]. Смена типаспаривания с а на α и наоборот у гетероталличных дрожжей может происходить так же,как и у гомоталличных за счет однонаправленной конверсии кассет в локус МАТ привозникновении спонтанных или индуцированных двунитевых разрывов в определенномучастке локуса МАТ, а также в результате реципрокной рекомбинации кассеты с локусомМАТ [117, 118, 120].К переключению типа спаривания α → а, но не наоборот, может приводить нетолько конверсия и рекомбинация кассеты HMRа с локусом MATα (рисунок 7.
А. Б), нотакже одновременное нарушение экспрессии MATα1 и MATα2 [14, 100, 120, 121]. Кодновременной инактивации MATα1 и MATα2 может приводить целый ряд событий, такихкак потеря хромосомы III (рисунок 7. В) и ее правого плеча (рисунок 7. Г), мутации иливременные (первичные) повреждения в обоих генах или двустороннем промоторе(рисунок 7. Д) [14, 15, 80, 120, 122, 123]. Все эти явления впервые наблюдали в 70-80-егоды XX в. в скрещиваниях клеток одинакового типа спаривания, несущих маркеры вхромосоме III, в селективных условиях.
Тогда же на основе анализа фенотипа гибридов,отобранных в скрещиваниях α×α, было показано наличие всех перечисленныхгенетических событий, приводящих к переключению типа спаривания α → а [51, 100,120]. Позже методом гель-электрофореза в пульсирующем поле и методом гибридизациина ДНК-микрочипах было подтверждено, что генные мутации, потери хромосомы III и ееправого плеча определяют Alf-фенотип [123-125]. Скрещивания α на α болееинформативны и позволяют выявить все описанные генетические события, тогда какскрещивания а×а позволяют выявлять только конверсию и рекомбинацию.34Рисунок 7. Генетические события, приводящие к переключению типа спаривания α → а угетероталличных штаммов дрожжей:А) конверсия кассеты HMRа в локус МАТα; Б) рекомбинация между HMRа и МАТα; В)потеря хромосомы III; Г) потеря правого плеча хромосомы III вместе с МАТα; Д)временные повреждения или генные мутации, произошедшие одновременно в обоих генахлокуса МАТα или в двустороннем промоторе.1.6.2.
Генетические события, учитываемые в альфа-тестеВ альфа-тесте используют два штамма гетероталличных дрожжей одинаковоготипа спаривания α с комплементарными селективными маркерами и маркированнойхромосомой III. Один из штаммов подвергают генотоксическому воздействию искрещивают со вторым на селективной среде, где вырастают только гибриды, но неродительские штаммы. "Незаконное" скрещивание клеток, исходно имеющих типспаривания α, произойдет только в том случае, когда одна из копулирующих клетоквременно или в результате мутационного изменения сменит тип спаривания α на35противоположный тип спаривания – а. Согласно принятой модели альфа-теста в клетках,подвергшихся генотоксическому воздействию, первичные повреждения ДНК нарушаютэкспрессию локуса MATα, что приводит к временному переключению типа спаривания α→ а, и делает возможным "незаконное" скрещивание α×α.
Значительная часть первичныхповреждений ДНК устраняется системами репарации безошибочно – происходитвосстановление структуры ДНК и возвращение дрожжевых клеток к исходному фенотипуα. Тем не менее, за время своего существования эти первичные повреждения успеваютповлиять на фенотип дрожжевых клеток, инициируя временное переключение типаспаривания α → а. Другая часть регистрируемых в альфа-тесте первичных повреждений входе репарации закрепляется в виде наследуемых изменений генетического материала:генных мутаций или хромосомных аберраций (потери хромосомы III или ее правогоплеча), а также провоцирует конверсию и рекомбинацию [14, 15, 80-82]. Все этигенетические события могут быть выявлены в двух взаимодополняющих тестах: системе"незаконной" гибридизации и системе "незаконной" цитодукции. Каждая системапозволяет регистрировать только часть событий, приводящих к "незаконному"скрещиванию клеток (таблица 2).Таблица 2.Генетические события, учитываемые в альфа-тесте и фенотип соответствующих"незаконных" гибридов и цитодуктантов.Генетическое событиеКонверсия кассеты HMRa в локус MATαРеципрокная рекомбинация междулокусомМАТα и кассетой HMRaФенотипФенотип"незаконного""незаконного"гибридацитодуктантаn/m His+Thr+аn/m His+Thr-Потеря правого плеча хромосомы IIIα His +Thr-Потеря хромосомы IIIα His-Thr-Мутация в локусе MATα (в MATα1 или MATα2)Мутации в MATα (одновременно в MATα1 илетальn/mα His+Thr+a*MATα2 или в двустороннем промоторе, делецииМАТα)рецессивный a36Временные (первичные) повреждения в локусеMATα (одновременно в MATα1 и MATα2, или вдвустороннемпромоторе),α (альфа)устраняемыерепарацией безошибочно после скрещиванияПримечание: Фенотипы цитодуктантов и гибридов приведены для случаяскрещивания двух штаммов одинакового типа спаривания α: тестерного (реципиентацитоплазмы) штамма (MATα HIS4 THR4) и партнера для скрещивания (MATα his4 thr4).Маркер his4 находится в левом, а маркер thr4 в правом плечах хромосомы III.
Фенотипn/m – не спаривающийся.Всистеме"незаконной"гибридизацииоцениваютчастотуобразованиядиплоидных гибридов в скрещиваниях штаммов дрожжей α типа спаривания (рисунок 8.А). Анализ фенотипа "незаконных" гибридов позволяет идентифицировать события,сопровождающиеся потерей обширных участков хромосомы III, такие как потерю всейхромосомы III или правого плеча хромосомы III вместе с локусом МАТα (рисунок 7 В. Г).Гибриды, образовавшиеся в результате этих событий, являются полными или частичнымимоносомиками по хромосоме III и поэтому имеют α тип спаривания (таблица 2).Реципрокная рекомбинация между кассетой HMRa и локусом МАТα приводит кобразованию ацентрического фрагмента правого плеча хромосомы III, включающего всебя участок хромосомы между этими локусами, а также к переключению типаспаривания α → а в исходной клетке за счет транспозиции генетического материала изHMRa в локус МАТα (рисунок 7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
