Диссертация (1145828), страница 6
Текст из файла (страница 6)
В большинстве стран мира, включаяРоссию, все новые лекарственные препараты, пищевые добавки, косметические и моющиесредства и другие потенциально опасные химические вещества подлежат обязательномутестированию на мутагенность и канцерогенность. Генетически активные факторы могутиндуцировать мутации различных типов, такие как генные, хромосомные и геномные. Дляобнаружения мутаций всех типов одного универсального метода не существует. Внастоящее время для оценки потенциальной генетической опасности различныххимических и физических факторов разработаны комплексы методов, позволяющиевыявлять мутагены и канцерогены на разных тест-объектах [59, 77-79]. Только 8 тестсистем, применяемых в генетической токсикологии, стандартизированы и утвержденыфармакологическим государственным комитетом (таблица 1).
Основными критериямигенетической активности в применяемых тест-системах служат такие показатели, какчастота генных мутаций, конверсии и реципрокной рекомбинации, хромосомных24аберраций, обменов между сестринскими хроматидами, нерасхождения хромосом вмитозе, а также увеличение частоты доминатных леталей и частоты аномальныхсперматозоидов [59, 77, 79]. В качестве биологических объектов используют наиболееизученные в генетическом плане виды бактерий, грибов и животных, а также клеткипериферической крови человека, костного мозга мышей и клеточные линии фибробластов[59, 77, 79].Таблица 1.
Тесты для выявления генетической активности химических веществ,утвержденные фармакологическим государственным комитетом.№ Тест-системаТест объектВыявляемые изменениягенетического материалаSalmonellatyphimuriumТочковыемутации(транзицииисдвиграмки считывания)1.Тест Эймса2.SOS-хромотестрепарации3.Рецессивные, сцепленные с полом (в D. melanogasterХ-хромосоме), летальные мутацииГенные мутации4.Митотическая рекомбинацияD.melanogasterРекомбинация5.Доминантные леталиMus musculusГенные мутации6.Хромосомные аберрации в костном Грызунымозге млекопитающихХромосомные аберрации7.Микроядерный тестПовреждения(фрагментацияхромосом)наиндукцию Escherichia coliМлекопитающие(полихромныеэритроцитыкостногомозгаиликрови,гепатоцитыгрызунов;лимфоцитыпериферическойкрови человека)8.Хромосомные аберрации в клетках Человекпериферической крови больных,подвергнутых действию препаратаПовреждения ДНКДНКХромосомные аберрации25Для того чтобы повысить скорость и эффективность анализа большого числапотенциально опасных факторов, а также снизить затраты на проведение тестирования,разработана концепция поэтапного тестирования с использованием различных батарейтестов [59, 77].
На первом этапе вещество тестируют на способность индуцировать генныемутации у микроорганизмов, а также цитогенетические нарушения, хромосомныеаберрации и генные мутации в клетках млекопитающих, культивируемых in vitro. Чащевсего применяют такие методы как: тест Эймса, получивший наиболее широкоеприменение и ставший "золотым стандартом" генетической токсикологии, SOSхромотест, тест по учету хромосомных аберраций в культурах фибробластов илилимфоцитах. На втором этапе в основном применяют цитогенетические методы для учетахромосомных аберраций в соматических клетках млекопитающих in vivo, метафазный иана-телофазный методы учета хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей икрыс и микроядерный тест, а также тесты для учета рецессивных мутаций, сцепленных сполом, летальных мутаций и соматической рекомбинации у дрозофилы.
На третьем этапедля оценки мутагенной активности вещества чаще всего используют метод учетадоминантных леталей у мышей, который позволяет оценивать способность веществаиндуцировать мутации в половых клетках [59]. При проведении клинических испытанийдля оценки опасности лекарственных средств все перечисленные тесты используют надоклинической стадии испытаний, а в заключительной стадии тестирования проводятисследование уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической кровибольных, принимавших препарат. Применяемые схемы тестирования и количество этаповможет варьировать в зависимости от тестируемого мутагенного или канцерогенногогенетически активного фактора [59, 77].Большинство применяемых тест-систем характеризуется высокой специфичностьюпо отношению к тестируемым мутагенным факторам. Разные тесты способны выявлятьгенетическую активность не у любого генотоксического агента.
Например, тест Эймсапозволяет выявлять только те генетически активные факторы, которые индуцируютгенные мутации, такие как два типа транзиций (С→Т и Т→С) и мутации сдвига рамкисчитывания. Генетические нарушения, выявляемые в генетических тест-системах,представляют собой результат нетождественной репарации ДНК с первичнымиповреждениями.Дляизученияпоследствийдействияразличныхфакторов,повреждающих ДНК, и эффективности систем репарации необходимо обладать методами,которые позволяли бы выявлять широкий спектр генетических нарушений, а такжерегистрировать первичные повреждения ДНК и результаты их устранения системами26репарации (различные типы мутаций или события тождественного восстановленияструктуры ДНК).
При проведении подобных исследований можно использовать несколькоразличных подходов: тест-системы, которые регистрируют разнообразные наследуемыеизменения генетического материала, и методы, выявляющие количество первичныхповреждений в клетках. Использование одновременно нескольких тестов значительноповышает стоимость проведения исследования, а также не всегда возможно сравниватьрезультаты, полученные в различных системах. С этой точки зрения может быть весьмаперспективно использование альфа-теста. Альфа-тест, в отличие от описанных методов,позволяет регистрировать генетическую активность агентов, вызывающих различные посвоей природе наследуемые изменения ДНК (точковые мутации, хромосомные аберрации,конверсию, реципрокную рекомбинацию), а также оценивать наличие первичныхповреждений по изменению фенотипа клетки и выявить последствия репарацииповрежденной ДНК в определенном локусе [51, 80].1.6.
Альфа-тест как метод для выявления фенотипического проявления первичныхповреждений и наследуемых изменений генетического материалаАльфа-тест был разработан на кафедре генетики и селекции (в настояшее времябиотехнологии) Санкт-Петербургского государственного университета в 80-е годыпрошлого века при изучении "незаконного" скрещивания клеток одинакового типаспаривания α у гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae [14, 15, 51, 81]. В ходедальнейшей разработки и оценки эффективности этой тест-системы было показано, чтоальфа-тест позволяет выявлять генетическую активность факторов различной природы,вызывающихкакмутационныеирекомбиногенные,такиненаследуемые(модификационные) изменения генетического материала [14, 80-82].
Эффективностьальфа-теста была подтверждена в исследованиях с использованием ряда мутагенов:1,2,7,8-диэпоксиоктана,аминофлуорена,β-пропиолактона,циклофосфамида,N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина,диэтилгексилфтолата,2-акрилонитриладиэтилстильбестрола, ультрафиолетового излучения (УФ), этилметансульфоната (ЭМС),эндогенного8-оксогуанина(8-ОГ),6-N-гидроксиламинопурина(ГАП),метилметансульфоната [16, 51, 82]. В альфа-тесте была протестирирована генетическаяактивность 10 известных канцерогенов, мутагенность которых не была показана ранее[18].
Помимо анализа генетической активности экзогенных мутагенов и канцерогенов,альфа-тест показал высокую эффективность при изучении дефектов системы синтеза ДНКв обход повреждений (TLS), осуществляемого специфическими TLS ДНК-полимеразами[17]. С использованием альфа-теста изучали индуцированный мутагенез при инактивации27TLS ДНК-полимераз Polζ, Pol η и Rev1. Таким образом, было показано, что альфа-тесттакже позволяет изучать фундаментальные механизмы становления мутаций.Отличительной особенностью альфа-теста является то, что при его использованиипоявляется возможность изучать фенотипическое проявление первичных поврежденийгенетического материала еще до их "безошибочного" устранения системами репарации[14, 16, 80-82].
Альфа-тест основан на использовании системы генетической регуляцииклеточного типа и особенностей переключения типов спаривания у гетероталличныхдрожжей Saccharomyces cerevisiae.1.6.1. Генетические механизмы, лежащие в основе альфа-теста1.6.1.1. Жизненный и клеточный циклы гетероталличных дрожжей SaccharomycescerevisiaeSaccharomycescerevisiae–этоорганизмысбиполярнойполовойнесовместимостью. Гетероталличные клетки дрожжей имеют устойчивую гаплоиднуюили диплоидную фазу и размножаются вегетативно почкованием (рисунок 3) [83-85].Рисунок 3. Жизненный цикл гетероталличных дрожжей Saccharomyces cerevisiae.Продолжительность стадий жизненного цикла, проводимых в гаплоидной илидиплоидной фазе, меняется в зависимости от условий среды.
При достаточном количестве28питательных веществ диплоидные клетки дрожжей размножаются путем митотическихделений. При недостатке питательных веществ, например, при голодании по азотудиплоидные клетки спорулируют, претерпевая мейоз с образованием гаплоидныхаскоспор, которые в благоприятных условиях прорастают, превращаясь в гаплоидныеклетки [83]. Образовавшиеся гаплоидные клетки принадлежат к одному из двух типовспаривания α или а [83].Гаплоидные клетки могут либо делиться путем митотических делений, либо в фазеG1 две клетки противоположных типов α и а спариваются, образуя диплоидные клеткиа/α, которые не способны скрещиваться, но могут спорулировать с восстановлениемгаплоидных спор обоих типов. [83, 85].
Клетки противоположных типов спариваниясекретируют феромоны: клетки а секретируют пептид — а-фактор; клетки α секретируютα-фактор (рисунок 4). Клетка одного типа спаривания несет на своей поверхностирецептор к феромону противоположного типа. Когда клетки а и α оказываются вблизидруг от друга, феромоны действуют на рецепторы, это приводит к остановке клеток настадии G1 клеточного цикла, а также к удлинению клеток в направлении партнера дляскрещивания [86, 87]. У гетероталличных штаммов все три клеточных типа а, α и а/αспособны к длительному вегетативному размножению.Рисунок 4. Копуляция двух гаплоидных клеток противоположных типовспаривания а и α, с образованием диплоидов а/α.29Выбор между альтернативными программами жизненного цикла дрожжевойклетки – митозом, конъюгацией и споруляцией – происходит в фазе G1 до точки "старта".Пройдя эту точку, клетка необратимо выходит из стадии G1 и проходит все остальныестадии клеточного цикла до следующей точки "старта" [87, 88].
Переход дрожжевымиклетками через точку "старт" зависит от наличия во внешней среде питательных веществ,размеров клеток, наличия феромонов [83]. Клеточный цикл дрожжевых клеток состоит из4 фаз, и длится 90-120 минут при температуре 30оС [85, 89, 90]. Для ориентировочногоопределения стадий клеточного цикла используют разные признаки. К морфологическимпризнакам относятся размеры клетки и почки и состояние ядра. В стадии G1 дрожжеваяклетка имеет одно ядро и округлую форму.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
