Диссертация (1145828), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Первичное повреждениеДНК или нарушения в других клеточных структурах, например, цитоскелете индуцируют77потерю хромосомы III. Клетка без хромосомы III переключает тип спаривания α → а,поскольку в этом случае не экспрессируются оба гена локуса MATα. Клетка, сменившаятип спаривания в результате потери хромосомы, может скрещиваться с клеткой типаспаривания а. В этом случае потеря хромосомы III является первичным событием, котороеприводит к переключению типа спаривания, еще до гибридизации (рисунок 28. Б).Рисунок 28. Возможные механизмы возникновения "незаконных" гибридов,лишенных хромосомы III.Для того чтобы проверить гипотезу о том, что потеря хромосомы III можетявляться первичным событием, которое приводит к переключению типа спаривания, иобразованию"незаконного"гибрида,мыприменилиоригинальныйподход,заключающийся в индукции направленной потери хромосомы III без применения агентов,повреждающих ДНК.
Известно, что транскрипция в центромерном районе хромосомынарушает нормальное прикрепление веретена деления к кинетохору, вследствие этогонарушается нормальное распределение хромосом в митозе, приводящее к существенномуповышению частоты потери хромосомы [136]. Мы исследовали эффект индукции потерихромосомы III посредством встраивания регулируемого галактозного промотора (pGAL1)в ее центромеру. Индукция транскрипции с галактозного промотора в полученном намиштамме K5-35B-Д924-cen3 происходит только на среде с галактозой, но не с глюкозой.78В альфа-тесте индукция транскрипции в центромере хромосомы III приводит кнаиболее сильному (в 5000 раз), из когда-либо наблюдавшегося, возрастанию частоты"незаконной" гибридизации, т.е.
не менее 5% всех клеток культуры, выращенной на средес галактозой, теряют хромосому III, а потеряв ее переключают тип спаривания α → а ивступают в "незаконное" скрещивание. На среде с глюкозой частота "незаконной"гибридизации и частота каждого из выявляемых классов "незаконных" гибридов уштамма, несущего промотор pGAL1 в центромере, не отличается от соответствующихзначений у штамма дикого типа (рисунок 29) (приложение С).Рисунок 29.
Частота "незаконной" гибридизации и классов "незаконных" гибридов,выявляемых в альфа-тесте у штамма дикого типа и штамма, несущего pGAL1 вцентромере хромосомы III на среде с глюкозой (YEPD) или галактозой (YEPG)Примечание: * – Значение частоты "незаконной" гибридизации достоверно по критериюКраскела-Уоллиса или критерию Вилкоксона (Р<0,05) отличается от частоты тех жесобытий, возникших у штамма дикого типа на среде с галактозой и глюкозой и штаммаK5-35B-Д924-cen3 на среде с глюкозой.На основе полученных нами данных можно сделать вывод о том, что клетки,потерявшие хромосому III, могут скрещиваться, а "незаконные" гибриды без хромосомыIII могут возникать в альфа-тесте несколькими способами: потеря хромосомы III можетпроисходить как до, так и после образования "незаконных" гибридов.793.6.
Изучение фенотипического проявления первичных повреждений генетическогоматериала в клеточном циклеЭффективностьустраненияпервичныхповрежденийвДНКразличнымисистемами репарации зависит от типа повреждений и стадии клеточного цикла, накоторой возникло это повреждение [132]. Для того чтобы изучить возможностьсохранения в ДНК первичных повреждений на протяжении нескольких стадий клеточногоцикла, мы исследовали эффект УФ излучения в альфа-тесте с использованием клетокдрожжей, заблокированных на стадии G1.3.6.1. Подбор условий для синхронизации дрожжевых штаммов, используемых вальфа-тестеВ настоящее время разработано довольно много различных методов, позволяющихполучать культуры дрожжей, синхронизированные на любой стадии клеточного цикла.Синхронизированными называют культуры, в которых не менее 95% клеток находятся наодной стадии клеточного цикла, а синхронность перехода из одной стадии в другуюсохраняется в течение одного или нескольких клеточных циклов.Столкнувшись с необходимостью получения синхронизированных культурдрожжей S.
cerevisiae, мы обнаружили, что далеко не все протоколы синхронизацииклеток дрожжей эффективны [166-168]. При использовании некоторых из нихсинхронизация не наступала вообще или была частичной. Мы использовали подход, воснову которого заложено использование таких агентов или мутаций, которые приводят костановке клеточного цикла на определенной стадии и, как следствие, синхронизациикультуры. Известно, что c помощью дрожжевых феромонов, химических ингибиторов итемпературно-чувствительных мутаций в гене циклин-зависимой киназы дрожжевыеклетки могут быть синхронизированы на различных стадиях клеточного цикла.
Например,обработка клеток альфа-фактором или внесение температурно-чувстительных мутацийcdc28-4 или cdc28-13 приводят к остановке клеточного цикла на стадии G1 [166-169],обработка гидроксимочевиной – к остановке на стадии S [166-168, 170], мутации cdc31-2,cdc28-1N и mps2-1 блокируют клеточный цикл на стадии G2 [171, 172]. В присутствиенокодазола происходит остановка на стадии перехода G2/M, мутация cdc15-2 приводит ксинхронизации в анафазе/телофазе митоза [166-168, 171].Мы проверили эффективность нескольких наиболее часто используемых методовсинхронизации клеток дрожжей.
Для оценки степени синхронизации мы использовалипроточную цитометрию. Проточная цитометрия позволяет по степени флуоресценции и80световойдисперсии,котораявозникаетприпрохожденииклетки,меченнойфлуоресцентными красителями, через лазерный луч в струе жидкости, определить размери форму клетки, а также оценить количество клеток, находящихся на разных стадияхклеточного цикла, по содержанию в них ДНК [143, 173].Обработка клеток альфа-фактором считается одним из наиболее удобных ивоспроизводимых способов синхронизации клеточных делений у дрожжей, поскольку вэтом случае достигается высокая степень синхронизации, которая сохраняется 2-3клеточных цикла [168, 174, 175].
Тем не менее, этот подход можно использовать толькодля гаплоидных штаммов, имеющих тип спаривания а и не несущих мутации по генам,которые кодируют рецепторы к феромону или контролируют передачу сигнала [174]. Дляпроведения альфа-теста можно использовать только штаммы, имеющие тип спаривания α,которые не могут быть синхронизированы альфа-фактором. Поэтому мы использовалисинхронизацию клеток альфа-фактором только в качестве позитивного контроля оценкистепени синхронизации с помощью проточной цитометрии. Для синхронизации штаммовтипа спаривания α может оказаться эффективным применение а-фактора, механизмдействия которого аналогичен механизму действия альфа-фактора [176, 177].
Этот методне является распространённым, возможно, в виду отсутствия коммерчески доступного афактора. В литературе мы обнаружили один пример использования а-фактора длясинхронизации дрожжей. Исследовательской группой из Лондона в 2012 году былразработан протокол синтеза а-фактора, и проведена успешная синхронизация альфаклеток в стадии G1 а-фактором [178]. При этом авторы данной работы использовали афактор в концентрации на порядок меньшей, чем стандартная концентрация альфафактора. Поскольку а-фактор недоступен, для синхронизации штаммов, используемых вальфа-тесте,мыиспыталиэффективностьиспользованиягидроксимочевиныинокодазола.Гидроксимочевинаингибируетферментрибонуклеотид-редуктазу,которыйконтролирует реакцию биосинтеза дезоксирибозид-дифосфатов из соответствующихрибо-нуклеотидов. Обработка клеток дрожжей гидроксимочевиной приводит к голоданиюпо предшественникам ДНК, репликация замедляется, что вызывает блок клеточного циклана стадии S [166, 170, 179]. Клетки, блокированные гиброксимочевиной на стадии S,имеют маленькие или средних размеров почки, а содержание ДНК в них соответствуетположению между пиками 1N и 2N на диаграмме, полученной с помощью проточнойцитометрии [167].
Штамм K5-35B-Д924 не синхронизируется гидроксимочевиной встандартной концентрации 200 мM (рисунок 30. Б), рекомендованной в большинстве81методик по синхронизации [166, 167]. Повышение концентрации гидроксимочевины до2000 мM также не приводило к синхронизации штамма K5-35B-Д924 (рисунок 30. В).Также стоит отметить, что гидроксимочевина в концентрации 100 мМ повышает частотувозникновения мутаций до 10 раз по сравнению со спонтанным уровнем [180]. Поэтому ееприменение для синхронизации может приводить к увеличению спонтанного фонавозникновения мутаций, а в нашей работе по изучению начальных этапов становлениямутации это нежелательно.Обработка клеток нокодазолом приводит к синхронизации дрожжевых клеток настадии перехода G2/M, ингибируя полимеризацию микротрубочек [131, 166, 175, 181,182].
Клетки, синхронизированные нокодазолом, имеют крупные почки, количество ДНКв клетке соответствует пику 2N [166, 167]. Нокодазол оказался неэффективным длясинхронизации использованных нами штаммов ни в стандартной концентрации (15мкг/мл), описанной в методиках по синхронизации дрожжевых культур, ни придвукратном увеличении его концентрации до 30 мкг/мл (рисунок 30. Г, Д). Дальнейшееувеличение дозы нокодазала приводило к снижению выживаемости и гибели дрожжевыхклеток. Таким образом, ни один из наиболее часто используемых методов синхронизациис помощью химических агентов не показал достаточной эффективности.82Рисунок 30. Оценка степени синхронизации клеток дрожжей штаммов K5-35-Д924(панели А-Д) при воздействии гидроксимочевиной и нокодазолом.
На панели А)представлен отрицательный контроль – штамм без обработки гидроксимочевиной илинокодазолом.Дляобработкиклетокиспользовалиследующиевещества:Б)гидроксимочевина, 200 мM; В) гидроксимочевина 2000 мM; Г) нокодазол, 15 мкг/мл; Д)нокодазол в 30 мкг/мл.83Поэтому для синхронизации культур штаммов дрожжей, применяемых в альфатесте, мы использовали мутацию cdc28-4. Температурно-чувствительная мутация cdc28-4нарушает активность циклин-зависимой протеинкиназы Cdc28 при температуре 37оС, чтопрепятствует переходу клеток дрожжей из стадии G1 в стадию S и приводит ксинхронизации клеток на стадии G1 [183, 184]. Протеинкиназа Cdc28 регулируетобразование почек и клеточный цикл, контролирует не только переход из стадии G1 в S,но и из G2 в M, посредством взаимодействия с циклинами Cln и Clb [172, 183, 185, 186].Активация белка Сdc28 циклинами Cln1, Cln2, Cln3 в стадии G1 запускает процессполяризации актинового цитоскелета, а в стадии G2 активация белка Сdc28 циклинамиClb1 и Cln2 вызывает деполяризацию актинового цитоскелета [187, 188].
Клетки cdc28-4при температуре 37°С не имеют почки, могут обладать увеличенным размером [184] иудлиненной формой, по сравнению с клетками cdc28-4 при температуре 22оС [189-192].Увеличение размера клеток cdc28-4 и изменение их морфологии при температуре 37°С,связывают с непрекращающимся после остановки клеточного цикла макромолекулярнымбиосинтезом, деполяризацией актинового цитоскелета, а также с нарушением регуляцииключевых генов рибосомных белков, которые участвуют в контроле роста клетки [191,192].Поскольку морфологические нарушения потенциально способны влиять нарезультаты проточной цитометрии, мы с помощью микроскопии изучили фенотипмутанта cdc28-4, полученного нами на фоне штамма К5-35В-Д924.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
