Диссертация (1145828), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Так, доля первичныхповреждений составляла 99%, при этом не было выявлено цитодуктантов класса"конверсия" (рисунок 37). Полученные данные подтверждают наше предположение о том,что возрастание частоты класса "мутации и временные повреждения" в тесте на"незаконную" гибридизацию в заблокированных на стадии G1 культурах происходит засчет возрастания частоты временных повреждений.92Рисунок 37. Распределение классов генетических событий, выявляемых в тесте на"незаконную" цитодукцию, при воздействии УФ излучения, в %.Примечание: (А) wt при воздействии УФ при температуре 22оС и (Б) 37оС; (В) cdc28-4 привоздействии УФ при температуре 22оС и (Г) 37оС. Доза УФ облучения составляла 17Дж/м2.Подчеркиванием отмечено достоверное изменение доли класса генетических событийпосле обработки УФ при температуре 37оС по сравнению с долей того же класса притемпературе 22оС (достоверность различий определяли по z-критерию (Р<0,05)).Возрастание частоты конверсии под действием УФ излучения у штамма cdc28-4при температуре 22оС и отсутствие класса конверсий при воздействии УФ у штаммаcdc28-4 при температуре 37оС (приложение У), когда клетки заблокированы на стадии G1,93может свидетельствовать о том, что конверсия в тесте на "незаконную" цитодукцию, восновном происходит еще до скрещивания клеток и для возникновения цитодуктантовэтого класса необходимо, чтобы клетка с первичным повреждением, прошла клеточныйцикл, в ходе которого первичное повреждение инициирует конверсию в ходе репарации, ав следующей за митозом стадии G1 конверсия приводит к переключению типа спариванияα → а.Данные, полученные с использованием культур, заблокированных на стадии G1,показывают, что первичные повреждения, индуцированные УФ излучением и возникшиена стадии G1, проявляются фенотипически на той же стадии, еще до их устранениясистемами репарации и превращения первичных повреждений в наследуемые изменениягенетического материала.
В случае применения асинхронных культур, первичныеповреждения,индуцированныеУФ-излучением,проявляютсяфенотипическикакповреждения, а их превращение в наследуемые изменения может происходить как до, таки после гибридизации и формирования «незаконного гибрида или цитодуктанта. Такимобразом, фенотипическое проявление первичных повреждений в альфа-тесте и ихпревращение в наследуемые изменения генетического материала до или после"незаконного" скрещивания зависит от стадии клеточного цикла, на которой онивозникли.При проведении тестов на "незаконную" гибридизацию и цитодукцию мыобнаружили, что у штамма cdc28-4 и штамма wt частота "незаконной" гибридизации ицитодукции, как спонтанная, так и индуцированная УФ излучением, при температуре37оС снижается по сравнению с частотой тех же событий при температуре 22оС(приложение Т-У).
Это может быть связано с тем, что на частоту "незаконного"скрещивания в альфа-тесте влияет физиологическое состояние клеток, вступающих вгибридизацию. В экспериментах по подбору условий проведения альфа-теста, мыустановили, что на частоту "незаконной" гибридизации влияют такие физическиепараметры, как температура, плотность и стадия роста дрожжевых культур, а такжеисточник углерода. Частота "незаконной" гибридизации снижалась в 6 раз в том случае,когда использовали культуру клеток с более высокой плотностью. При этом в тесте назаконную гибридизацию такого эффекта не наблюдали. При использовании различныхисточников углерода (глюкозы и глицерина) мы обнаружили, что при инкубации клетокна среде с глицерином частота "незаконной" гибридизации снижается в 3 раза посравнению с контролем, в котором клетки выращивали на среде с глюкозой.
При изучениивлияния пониженной температуры (18оС) на частоту "незаконной" гибридизации мы94обнаружили, что значение частоты ниже при 18°С, чем при 30°С. Эти данные указываютна то, что фенотипическое проявление первичных повреждений ДНК в альфа-тесте можетзависеть от скорости деления клеток.95Глава 4. Обсуждение4.1. Молекулярная природа первичных повреждений, способных проявлятьсяфенотипическиИзучив в альфа-тесте эффекты эталонных мутагенов и блоков путей репарации,которые вызывают повреждения ДНК одного определенного типа, мы впервыеопределили молекулярную природу первичных повреждений, которые способныпроявляться фенотипически.
Мы показали, что модификации оснований, двунитевыеразрывы, циклобутановые пиримидиновые димеры и 6-4 фотопродукты могут влиять нафенотип дрожжевых клеток, приводя к временному переключению типа спаривания α →а, еще до устранения этих первичных повреждений в ходе репарации (приложение В, Д,Н, Р). Таким образом, мы подтвердили, что изменение фенотипа клеток можетпроисходить в результате возникновения первичных повреждений в ДНК до ихпревращениявнаследуемыеизменения.Неспаренностиоснованийнеимеютсамостоятельного фенотипического проявления в использованной системе. Нам удалосьзафиксировать лишь наследуемые изменения генетического материала, индуцированныенеспаренностями, которые накапливаются на фоне инактивации гена PMS1 (приложениеЖ, К).
Полученные результаты указывают на то, что первичные повреждения различныхтипов в разной степени влияют на фенотип. Мы полагаем, что обнаруженные различияобусловлены различной способностью первичных повреждений блокировать матричныепроцессы.Неспаренности оснований возникают при репликации или, реже в ходерепаративного синтеза ДНК, и представляют собой неправильную пару каноническихнуклеотидов. В этом случае химическая структура каждой из цепей ДНК в отдельностиничем не отличается от нормальной ДНК и не несет никаких повреждений, поэтомупроцессы репликации или транскрипции протекают без нарушений, а неспаренности непроявляются фенотипически в альфа-тесте.
Другая ситуация наблюдается при наличииизменений химической структуры ДНК, таких как модификации оснований, двунитевыеразрывы или циклобутановые пиримидиновые димеры и 6-4 фотопродукты [76, 155, 156,198]. УФ-излучение индуцирует такие высоко-мутагенные и токсичные повреждения, какциклобутановые пиримидиновые димеры и 6-4 фотопродукты, которые вызываютостановку вилки репликации [64, 76].
Остановку вилки репликации также вызываютдвунитевые разрывы ДНК. Двунитевые разрывы могут возникать при воздействииразличными повреждающими агентами, которые приводят к разрыву ковалентных связей96между нуклеотидами в обеих цепях ДНК, или при достижении реплисомой однонитевогоразрыва в матричной цепи, а также в качестве промежуточного продукта при репарацииДНК с повреждениями других типов, таких как модифицированные основания,апуриновые сайты, однонитевые разрывы [4]. Двунитевые разрывы способны запускатьактивацию контрольных точек (чекпойнтов). На стадии G1 активация чекпойнта, зависитот количества двунитевых разрывов [198]. Клетки с двунитевыми разрывами могутдостигать стадии S, где двунитевые разрывы индуцируют остановку вилки репликации, иустраняются гомологичной рекомбинацией, превращаясь в наследуемые изменения.Двунитевые разрывы эффективнее активируют чекпойнт G2/M, чем на стадии G1.Репликация ДНК с двунитевыми разрывами существенно усиливает последующуюактивацию чекпойнта G2/M [198].
Таким образом, двунитевые разрывы не могутсуществовать в клетке дольше одного клеточного деления, и в ходе репарации либоустраняются точно, либо приводят к наследуемым изменения генетического материала,таким как делеции, транслокации, и потери хромосом [4]. Первичные повреждения,существенно нарушающие структуру ДНК, естественным образом блокируют работуферментов репликации, транскрипции и репарации и поэтому могут влиять на реализациюгенетическойинформации.Такимобразом,однимизсущественныхфакторов,определяющих способность первичных повреждений проявляться фенотипически,является степень вызываемых ими нарушений химической структуры ДНК.
Нельзяисключать наличие других факторов, способных модифицировать фенотипическоепроявлениепервичныхповреждений.Мыпредположили,чтодлительностьсуществования первичных повреждений до момента их устранения, а также дальнейшаясудьба первичных повреждений после устранения посредством репарации во многомзависит от стадий клеточного цикла, на которой возникли первичные повреждения.4.2. Особенности устранения различных типов первичных повреждений в ходеклеточного циклаЕжедневно в каждой клетке под действием экзогенных и эндогенных факторовпоявляется несколько тысяч различных повреждений генетического материала, которые вразной степени нарушают структуру ДНК, препятствуют репликации и транскрипции и,как следствие, негативно влияют на передачу и реализацию генетической информации.Появление повреждений генетического материала индуцирует несколько типов ответа вклетке: 1) остановка клеточных делений и гибель клетки (апоптоз); 2) реакции временнойустойчивости к повреждениям (пострепликативная рекомбинация и синтез в обход97повреждений); 3) репарация.
Мутагенными являются реакции временной устойчивости ирепарация.Репликативные ДНК-полимеразы не способны подставлять нуклеотиды напротивпиримидиновых димеров или 6-4-фотопродуктов, а также целого ряда другихповреждений, поэтому при достижении вилкой репликации УФ индуцированногоповреждения в матричной цепи репликативная ДНК-полимераза диссоциирует, а синтезДНК прекращается. Подобные затруднения могут быть разрешены посредством двухальтернативных механизмов. Один из них – синтез ДНК в обход повреждения (TLS). Входе TLS репликация ДНК с повреждениями, блокирующими матричный синтез, можетосуществляться специфическими ДНК-полимеразами [134, 199, 200]. ДНК-полимераза η свысокой точностью и эффективностью может подставлять два аденина напротив cis-synтиминовых димеров, которые чаще всего возникают под действием УФ излучения [201,202].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
