Диссертация (1145828), страница 18
Текст из файла (страница 18)
У эукариотическихклеток транскрипция затруднена тем, что ДНК упакована в нуклеосомы и в ходеэлонгации происходит суперспирализация, возникающая при расплетании двойной цепиДНК. Для того чтобы РНК-полимеразы не останавливались, топоизомераза I осуществляетрелаксацию путем внесения однонитевого разрыва в ДНК. В ходе инициации Top1убирает негативные спирали, способствуя разборке нуклеосомы.
При элонгациисовместно Top1 и Top2 снижают спиральное напряжение индуцированное активностью101РНК-полимеразы Pol II. При терминации активность топоизомеразы необходима дляподдержания сайтов терминации транскрипции [216]. Когда камптотецин образуеткомплекс с ДНК и топоизомеразой I происходит замедление работы РНК-полимеразы натранскрибируемой цепи ДНК и наступает блок элонгации [161-163]. Нарушение работытопоизомеразы I, вызванное камптотецином, приводит к закручиванию двойной спиралиДНК в противоположную сторону и появлению отрицательной суперспирализации, чтоможет приводить к формированию R-петель, которые представляют собой гибрид РНКДНК и однонитевой ДНК. Камптотецин также подавляет SR-киназную активностьтопоизомеразы I, что тоже приводит к формированию R-петель и инактивации сплайсинга[161, 164].
Накопление R-петель приводит к возникновению двунитевых разрывов,механизм их возникновения точно не известен [164]. Показано, что в клетках человека Rпетли, инициированные нарушением активности топоизомеразы I, превращаются вдвунитевые разрывы за счет активности эндонуклеаз XPF и XPG, которые играютключевую роль в осуществлении репарации с неспаренными нуклеотидами [218, 219].Описано несколько моделей превращения R-петель в двунитевые разрывы в ходеэксцизионной репарации нуклеотидов. Эндонуклеазы XPF и XPG могут вырезать обе цепиR-петли с образованием двунитевого разрыва, либо могут вырезать РНК-ДНК гибрид, врезультате чего образуется однонитевой разрыв, который может превратиться вдвунитевой в ходе эксцизионной репарации нуклеотидов или при столкновении с вилкойрепликации [219].
У дрожжей гомологами XPF и XPG являются RAD1 и RAD2,соответственно [220, 221]. Приведенные литературные данные указывают на то, чтокамптотецин может индуцировать двунитевые разрывы не только на стадии S, связываясьс топоизомеразой I при репликации, но и в ходе транскрипции на стадии G1. Такимобразом, на основе данных, полученных при изучении эффекта камптотецина в тестах на"незаконную" гибридизацию и цитодукцию, можно сделать вывод о том, что частьдвунитевых разрывов, индуцированных камптотецином, фенотипически проявляется вальфа-тесте именно на уровне первичных повреждений.
Фенотипическое проявлениедвунитевых разрывов зависит от стадии клеточного цикла, на котором возникло этоповреждение.Совокупность данных, полученных в нашей работе позволят предложитьследующий механизм фенотипического проявления первичных повреждений в связи состадиями клеточного цикла в альфа-тесте. Если первичное повреждение возникло настадии G1 и привело к временному переключению типа спаривания, то клетка можетвступать в скрещивание с образованием "незаконного" гибрида или цитодуктанта.102Устранение этого первичного повреждения произойдет после скрещивания дрожжевыхклеток (рисунок 38.
А). В этом случае именно первичное повреждение стало темсобытием, которое привело к переключению типа спаривания, а альфа-тест позволилзафиксировать его фенотипическое проявление. Если первичное повреждение возникло надругих стадиях клеточного цикла S, G2 или M, то оно может быть устранено системамирепарации еще до скрещивания дрожжевых клеток. К следующей стадии G1, гдевозможно скрещивание дрожжевых клеток, первичное повреждение уже превратится внаследуемоеизменениегенетическогоматериала,котороеибудетпричинойпереключения типа спаривания клетки α → а. В этом случае самостоятельноефенотипическое проявление первичного повреждения в альфа-тесте увидеть невозможно(рисунок 38. Б). Тем не менее, частота "незаконной" гибридизации или цитодукцииотражает общую частоту, индуцируемых изучаемым мутагенным фактором, первичныхповреждений, часть из которых мы фиксируем на уровне первичных повреждений, а частьна уровне наследуемых изменений, которые возникли в ходе нетождественной репарацииДНК с первичным повреждением.
Чем больше клеточных циклов будет проходить клеткаот момента возникновения первичного повреждения до скрещивания, тем большевероятность того, что в альфа-тесте будет зафиксировано проявление наследуемогоизменения, а не первичного повреждения.103Рисунок 38. Фенотипическое проявление первичных повреждений, возникших (А) настадии G1 и (Б) на стадиях S, G2 и М клеточного цикла.Таким образом, если первичное повреждение возникло на стадиях S, G2, или M,возможность его фенотипического проявления во многом зависит от молекулярнойприроды повреждения и его способности блокировать репликацию. Например,модификацииоснований,индуцированныеаналогамиоснований,неблокируютрепликацию, поэтому даже если они возникли на стадиях S, G2 или M клеточного цикла, кстадии G1, когда становится возможным скрещивание дрожжевых клеток, модификацииоснований могут сохраниться в неизмененном виде и проявиться фенотипически.
Хотяпервичные повреждения, индуцированные УФ излучением, блокируют синтез ДНК,осуществляемый репликативными ДНК-полимеразами, они могут сохраниться в ДНК настадиях S и G2, благодаря механизмам, обеспечивающим временную устойчивость кповреждениям, и проявиться фенотипически на стадии G1 в следующем клеточном цикле.ДвунитевыеразрывыДНКобязательнодолжныбытьустраненыпосредствомгомологичной рекомбинации на стадии G2 клеточного цикла.
Двунитевые разрывы неспособны сохранятся в ДНК при переходе из стадии S в G2 и M. Даже если клетки снебольшим количеством двунитевых разрывов успевают пройти чекпойнт G2/M до егоактивации и вступают в деление, то в ходе деления происходит потеря хромосомы III илиеё плеча, что приведет к переключению типа спаривания и "незаконному" скрещиванию в104следующей за митозом стадии G1. Двунитевые разрывы, возникшие за пределами стадииG1 не имеют самостоятельного фенотипического проявления в альфа-тесте, онипревращаются в наследуемые изменения, которые и учитываются в альфа-тесте.Двунитевые разрывы могут проявиться фенотипически в альфа-тесте только в том случае,если они возникли на стадии G1 и привели к переключению типа спаривания на этой жестадии клеточного цикла.Наши выводы от том, что фенотипическое проявление первичных повреждений удрожжей зависит от стадии клеточного цикла и типа первичного повреждения, можно внекоторой степени экстраполировать и на другие организмы.
Можно предположить, что умлекопитающих способность первичных повреждений влиять на фенотип также зависитот химической структуры повреждения и от значения экспрессии гена, в которомвозникло повреждение, в определенный промежуток времени, на определенной стадииклеточного цикла, в определенной ткани или в определенный период развития организма.В использованной нами тест-системе экспрессия репортерного локуса MATα имееткритическое значения на стадии G1, когда происходит скрещивание дрожжевых клеток.Нарушение экспрессии MATα может приводить к изменению фенотипа дрожжевых клетоктолько на этой стадии.
Особенности использованного нами модельного организмаопределяют то, что мы вынуждены рассматривать способность первичных поврежденийпроявляться фенотипически именно относительно стадии G1. Тем не менее, у другихорганизмов или в других генетических системах фенотипическое проявление первичныхповреждений может происходить на других стадиях клеточного цикла. Поэтому прииспользовании полученных нами данных для описания возможного фенотипическогопроявления первичных повреждений у других организмов необходимо учитыватьбиологическую функцию рассматриваемого гена, уровень его экспрессии на той или инойстадии клеточного цикла, его значения в ходе онтогенеза.Нашиданныенаследственнойивносятвкладмодификационнойвпониманиеизменчивости.фундаментальныхмеханизмовФенотипическоепроявлениепервичных повреждений, представляющее собой временные повреждения локуса MATα,которые после скрещивания дрожжевых клеток исчезают бесследно, является примероммодификационных изменений.
Можно предположить, что модификационные изменения,например, морфозы у дрозофилы или врожденные, но ненаследуемые изменения умлекопитающих, могут возникать в результате фенотипического проявления первичныхповреждений в определенные периоды развития организма. Таким образом, наследуемыеизменения и модификационные изменения могут иметь общий механизм возникновения, а105именно возникать при нетождественном или тождественном устранение первичныхповреждений в ходе репарации.4.3.
Преимущества и ограничения альфа-тестаПреимущество альфа-теста по сравнению с другими методами, выявленияпервичных повреждений ДНК, заключается в том, что альфа-тест позволяет оценивать нетолько частоту возникновения первичных повреждений генетического материала, но ипроследить их дальнейшую судьбу после репарации. В альфа-тесте можно определитьдолю первичных повреждений, индуцирующих различные типы наследуемых измененийгенетического материала, таких как генные мутации, конверсия, рекомбинационныесобытия потери целой или плеча хромосомы. Еще одним преимуществом альфа-тестаявляетсявозможностьпрослеживатьдлительностьсуществованияпервичныхповреждений относительно стадий клеточного цикла.
Это возможно благодаря тому, чтодрожжевые клетки могут вступать в гибридизацию только на стадии G1, поэтому"незаконное" скрещивание отражает не только факт повреждения локуса MATα, нопоказывает, что оно проявилось в виде переключения типа спаривания на стадии G1,независимо от того, на какой стадии клеточного цикла возникло первичное повреждение.Таким образом, общая частота "незаконной" гибридизации или цитодукции отражаетчастоту возникновения первичных повреждений в локусе MATα.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
