Диссертация (1145736), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Это свидетельствует о том, что пептид №1 и белкидрозофилы связываются с одним и тем же паратопом антител и, следовательно, наблюдаемыйсигнал в районе 42 кДа (отмечен стрелкой на Рис. 31) является специфичным и соответствуетбелку SBR. Помимо этого, несмотря на то, что антитела были получены в кроликах наконъюгат пептида с БСА, очищенные антитела не демонстрирую аффинности к БСА, посколькусвязывание антител с белками дрозофилы после инкубации антител с БСА не изменяется.Рисунок 31. Тестирование антител на растворимой фракции тотального белка дрозофилы. 1 –инкубация с антителами (5 мкг/мл); 2 – инкубация с антителами, преинкубированными спептидом, который использовали для наработки антител; 3 – инкубация с антителами,преинкубированными с конъюгатом пептид-БСА, который непосредственно использовали прииммунизации; 4 – инкубация с антителами, преинкубированными с БСА.
Инкубация спептидом или конъюгатом пептид-БСА полностью блокирует связывание антител с белкамидрозофилы. Стрелкой отмечен белок дрозофилы, с которым специфически взаимодействуютантитела.783.10.2Результаты вестерн-блот анализа белков, выделенных изразных органов взрослых особей D. melanogasterДля вестерн-блот анализа были взяты растворимые фракции белков дрозофилы,выделенные из разных органов взрослых особей линии дикого типа Oregon-R: из голов, изяичников, из семенников. Короткий белок с расчётной молекулярной массой около 42 кДа намудалось выявить в образцах из яичников и голов самок (Рис.
32). Этот белок SBR, кодируемыйинтрон-содержащим транскриптом, мы будем далее называть SBR-ir от «intron retention» –сохранение интрона. Также на вестерн-блоте мы видим ещё две области связывания антител, носклонны считать это неспецифическим связыванием или результатом протеолиза. Мы недетектируем полноразмерный белок SBR массой около 76 кДа.
Этому может быть несколькообъяснений, например, что используемый метод детекции недостаточно чувствителен, чтобывыявить белок SBR, содержащийся в, по-видимому, гораздо меньшей концентрации, чем белокSBR-ir. Дальнейшая оптимизация методики вестерн-блота и пробоподготовки позволитустановить причину наблюдаемого отсутствия универсального белка SBR.Рисунок 32. Результаты вестерн-блот анализа белков, выделенных из разных органов взрослыхособей D. melanogaster линии Oregon-R. яич. – яичники, сем. – семенники, гол.
– головы.Стрелка указывает на короткий белок SBR-ir, кодируемый транскриптом с сохранённыминтроном 5.793.11 Выявленные экспериментально белки SBRВсе белки, которые возможно детектировать двумя типами антител (к N- и C-концуSBR), перечислены на рисунке 33.Рисунок 33.ЭкспериментальнообнаруженныебелкиSBRD. melanogaster.SBR–полноразмерный белок; SBR-t – укороченный с N-конца белок, специфичный для семенников;SBR-ir – укороченный с C-конца белок, кодируемый интрон-содержащим транскриптом ивыявляемый в тканях голов и яичников; SBR12 – полноразмерный белок с делецией 10 ак,продукт аллеля sbr12; SBR12-t – укороченный с N-конца семенниково-специфичный белок сделецией 10 ак, продукт аллеля sbr12.Что касается остальных предсказанным по последовательностям транскриптов белков(см.
таблицу 4), нам не удалось выявить белки массой 60, 64 и 67 кДа. в яичниках (Рис. 28,дорожка 1) и белок 48 кДа в образцах из голов дрозофил. По-видимому, такие белковые формылибо не существуют, либо менее представлены, чем полноразмерные белки.80Глава 4 ОбсуждениеВ предыдущих исследованиях было показано, что для гена Nxf1 дрозофилы характеренбольший полиморфизм продуктов экспрессии, по сравнению с Nxf1 млекопитающих. Ранеебыло установлено, что гену sbr соответствуют по меньшей мере 4 транскрипта, три из которыхпроявляют специфичность по отношению к определённому органу (головному ганглию илисеменникам) (Ivankova et al.
2010). В настоящей работе были охарактеризованы 19 возможныхтранскриптов sbr, которые образуются путём использования различных промоторов, сайтовполиаденилирования или через сохранение интрона. Для отдельных транскриптов быладоказана способность кодировать белок, и открыты две новые белковые изоформы SBR.Поскольку ген sbr эволюционно древний и обладает плейотропным эффектом, т.е. оказываетвлияниенанесколькопризнаков,именноразличныепродуктыгена,будучитканеспецифичными, могут обеспечивать реализацию различных функций.4.1Альтернативные сайты инициации транскрипции иполиаденилирования.4.1.1 Альтернативное полиаденилирование транскриптов гена sbrДлямРНКполиаденилированиегенов,которыеявляетсяболееэкспрессируютсяраспространеннымповсеместно,механизмом,альтернативноечемсредитканеспецифичных генов (Lianoglou et al.
2013). Этому правилу, по-видимому, следует и гендомашнего хозяйства sbr у Drosophila, основная функция которого – неспецифический экспортклеточных мРНК из ядра в цитоплазму.Для большинства генов домашнего хозяйства характерны разные изоформы 3'UTR.Различные 3’UTR позволяют по-разному регулировать экспрессию одного и того же гена напост-транскрипционном уровне (Lianoglou et al. 2013). В 3'UTR мРНК может находитьсянесколько сайтов полиаденилирования, и от того, какой из этих сайтов будет использован,зависит набор последовательностей, включённых в 3'UTR, и, следовательно, дальнейшая судьбазрелой мРНК. В 3'UTR часто располагаются последовательности-мишени микроРНК, и другиерегуляторные элементы, взаимодействующие с РНК-связывающими белками (Jing et al.
2005;Bartel, 2009; Fabian et al. 2010; Hollerer et al. 2014; Miura et al. 2013). Если в результате АПАтакие последовательности не попадают в зрелую мРНК, её статус изменяется: меняетсястабильность мРНК, локализация в цитоплазме и эффективность трансляции (Ji et al. 2011;Lewis et al. 1995; Moore, 2005; Matoulkova et al. 2012; Edwalds-Gilbert et al. 1997; Zhao et al.1999; Yan and Marr, 2005; Di Giammartino et al.
2011; Hafez et al. 2013; Lianoglou et al. 2013; Tianand Manley, 2013). Это важно для того, чтобы белок синтезировался в нужное время и в нужномместе, как это происходит, например, при нейрогенезе, оогенезе или сперматогенезе. Если81недоступные для трансляции мРНК при транспортировке утрачивают факторы-ингибиторытрансляции, может происходить нежелательная активация трансляции. В этом случае TDDбыстро элиминирует такие мРНК. В то же время трансляция в нужном месте и в нужное времяпозволяет избежать TDD, приводя к накоплению мРНК и соответствующих белков (Ashraf et al.2006; Schratt et al.
2006).Формирование3'UTRзрелоймРНКвключаетрасщеплениеипоследующееполиаденилирование (Colgan and Manley 1997; Beaudoing et al. 2000). Расщепление транскриптапроисходит с участием большого белкового комплекса, для него важны определенныепоследовательности в мРНК (см. обзоры Colgan and Manley, 1997; Edwalds-Gilbert et al. 1997;Beaudoing et al. 2000; Coll et al. 2010). Во-первых, мультисубъединичный CPSF (cleavage andpolyadenylation specificity factor) узнаёт сайт полиаденилирования (PAS), располагающийся за10-30 н.
до сайта расщепления (CS – cleavage site) (Keller et al. 1991; for reviews, see Keller 1995;Manley 1995). В ~70 % случаев PAS – это гексануклеотиды ААUААА или AUUAAA (т.н.мажорные сайты), и в ~30% – другие, например, UAUAAA, ACUAAA, ААСААА (Beaudoing etal. 2000), AAAAAA, AUAAAA, AAAUAA, AAAAUA, AUAAAU, UUUUUU, AUAAAG,UAAAAA (Ni et al. 2013), AGUAAA, AAGAAA (Anand et al.
1997) (т.н. минорные сайты).Второй фактор – CstF (cleavage stimulation factor) – связывается с более вариабельной GUбогатой последовательностью, называемой DSE (downstream sequence element), она находитсяпосле CS (см. обзоры Colgan and Manley 1997; Danckwardt et al. 2008; MacDonald et al. 1994).CPSF и CstF сообща привлекают факторы полиадинилирования (Keller et al. 1991; MacDonald etal. 1994; Proudfoot, 2011). На эффективность полиаденилирования влияют и дополнительныеэлементы UGUA или UAUA – USE (upstream sequence elements), которые предшествуютгексануклеотиду (Sartini et al.
2008; Yang and Doublié, 2011; Matoulkova et al. 2012; Shi, 2012), атакже последовательность поли(U) перед ними (MacDonald et al. 1994; Takagaki and Manley1997). Перечисленные сигнальные последовательности важны для формирования 3'UTR нетолько у позвоночных, но и у дрозофилы (Retelska et al. 2006; Coll et al.
2010; Lutz and Moreira2011; Darmon and Lutz, 2012; Tian and Manley, 2013).В 3' UTR мРНК sbr присутствует несколько мажорных и минорных гексануклеотидов,являющихся потенциальными сайтами полиаденилирования, а также USE-элементы перед ними(Рис. 34).
Это свидетельствуют о возможности регуляции экспрессии этого гена на посттранскрипционном уровне путём альтернативного полиаденилирования. В этой работеполучены экспериментальные доказательства существования в тканях семенника, головы ияичника транскриптов гена sbr, укороченных с 3'-конца (звёздочки и буквы “c” на рис. 34). Всоответствующих позициях 3'UTR мРНК sbr существуют последовательности, необходимыедля осуществления полиаденилирования: poly(U)-tract, USE, PAS, DSE.82135701364013710137801385013930140001407014140142101428014350minPASсGCUUUUAUGAAGUAAaucgcauaggaguuuccguaggacagagccgcgugccacauccacauaaucgaauполи(U)-трактUSE majPASсссссgcuguuuuuuuuuuuuugguuuuguaauuaaauuuuaaaauuauuagagaaaccucuauauaauaauaauDSEaauuaauauuauuaagcugcgaaguugugugcacauucgggcaguagcaauuauuaucccagcacugcggmiR-281-2miR-184gcaaugugcaucaacgaucacaguucuucgauagauuaguuuagcucucuuuaaguuccguccgcagauccgcuggucuacauugaggccaggacgagucugcgaacgguagucccuuuagaguuaaaguuguuuuagau*majPASuccuaagccaaacaccuucaaacacacacaacacgacaacacuauuaaacguaaugcaacaauguugucgUSEaaucgaaagaaacccaauuuuuauuuuaauauauacgacgauaccgaaaccaaggcgauggucgaaaagcUSEauggaucgcgccaauaauucuauauuccccgcuuucccagauccucgacucgccuuacauuuuguauacamajPASUSEUSEaauaccauagaauaaaaagaaacauuuugaccacuguaaaaauuuuguaacgcucggaaaccaaaauuacmiR-1014cuuuauuucuuaauagaaaaaaauuauucgauuuacaauacacgcuuagccguaaauucaauugaauuuaUSEminPASUSEmajPASaguguaagauauauaaaaauuauauacauuaagacaaaaguguagauucauaaauaaauuuuucagaaua*gaauРисунок 34.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
