Диссертация (1145736), страница 16
Текст из файла (страница 16)
2013; Mamon et al. 2013), что упрощает егоисследование с применением методик, основанных на ПЦР. Поэтому не получив однозначногоответа о факте терминации транскрипции в интроне 5 дрозофилы, мы попытались выяснить,оканчиваются ли транскрипты гена Nxf1 в интроне 10 у домовой мыши. Кроме того, винтроне 10позвоночныхмыобнаружилидваконсервативныхминорныхсайтаполиаденилирования AAGAAA (Рис. 24, анализ проведён С.
Ф. Кливером) и хотели проверитьих функциональность, поэтому выбрали несколько разных тканей мыши для исследования.Рисунок 24. Фрагмент выравнивания интронов 10 генов Nxf1 млекопитающих. Красной рамкойвыделен гексануклеотид AAGAAA, являющийся минорным сайтом полиаденилирования(PAS1), который является консервативным. Эволюционно-консервативными являются иокружающие гексануклеотид последовательности, значимые для АПА.
Анализ проведёнС. Ф. Кливером.В анализ были взяты несколько тканей: ткань мозга, мышечная ткань бедра, семенник.Схема проведения 3’ RACE-PCR была следующая: праймер I раунда в экзоне, предшествующемсохраняемому интрону, праймеры II и III раундов – в сохраняемом интроне (Рис. 25). По68результатам ПЦР можно утверждать, что в тканях семенника содержание транскриптов синтроном исчезающее мало, поскольку мы не выявляем их, а в нервной и мышечной тканяхтранскрипты гена Nxf1 (как содержащие, так и не содержащие интрон 10) заканчиваются в3’UTR описанной полноразмерной мРНК (Рис. 25).
В образцах из мышц существует небольшоеколичествотранскриптов,приобразованиикоторыхиспользуетсяминорныйсайтполиаденилирования (PAS1).Рисунок 25. Поиск транскриптов гена Nxf1 M. musculus, оканчивающихся в интроне 10. Сверхуданасхематранскриптафланкирующимиэкзонами.генаMm nxf1Синимииувеличенноестрелкамиотмеченыизображениеинтрона 10спраймеры;зелёными–консервативные участки; PAS – консервативные сайты полиаденилирования. А – I раундRACE-PCR с праймером Mm369F в экзоне 10, предшествующем интрону. В образце изсеменников можно видеть только фрагмент, соответствующий полноразмерному полностьюсплайсированному транскрипту, в котором интрон 10 не сохраняется (ожидаемая длина1281 п.н.).
При увеличении количества циклов ПЦР в тканях мозга и мышечной тканипоявляется такой же фрагмент. Б – II раунд RACE-PCR с праймером 369R_r_c до первого PAS.Ампликон на кДНК мозга соответствует полноразмерному транскрипту, а в мышцах продукт450 п.н.
свидетельствует об использовании PAS1 (ожидаемая длина 434 п.н.). В – III раундRACE-PCR с праймером Mm_CTE между первым и вторым PAS. При использовании69праймеров в интроне (раунды II, III), продукты ПЦР в образце из тканей семенников невыявляются. Секвенирование фрагмента длиной около 2000 н. доказало, что транскрипты генаNxf1 с сохранённым интроном 10 в нервной и мышечной тканях M. musculus заканчиваютсятам, где это описано в базе данных (ожидаемая длина 2103 п.н.) (GenBank NM_001276704.1).Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии транскриптов,заканчивающихся в интроне 10, по крайней мере, в одной из трёх проанализированных тканеймыши.3.7Разнообразие транскриптов гена sbr в тканях головы,семенников и яичников D.
melanogasterВсе транскрипты, кроме сохраняющих интрон, не имеют каких-либо структурныхотличий друг от друга, а лишь характеризуются по-разному расположенными точками стартатранскрипции и используемым сайтом полиаденилирования на 3’-конце, поэтому вбольшинстве случаев невозможно установить однозначное соответствие между 5’- и 3’концами транскриптов, определёнными методом RACE-PCR. Это можно сделать только длятранскриптов семенников, т.к. все они заканчиваются в одной области. На рисунке 26 наиболееполно представлены все вероятные транскрипты гена sbr, содержащиеся в исследуемыхорганах.Рисунок 26. Состав всех вероятных транскриптов гена sbr, выявленных в разных органах спомощью метода RACE-PCR.
Для каждого органа под наименьшим номером изображён самыйраспространённый транскрипт, далее транскрипты расположены по убыванию в том или иноморгане дрозофилы. Справа вычислены длины транскриптов в тысячах нуклеотидов.Звёздочками отмечены уникальные для органа транскрипты, не выявленные в других органах.Серые блоки обозначают нетранслируемые области (5’UTR и 3’UTR), чёрные – экзоны,штриховкой выделен сохранённый интрон 5.70713.8Потенциальное разнообразие белков, кодируемыхгеном sbrВсепредставленныенарисунке 26транскриптыспособны кодироватьбелок.Удивительно, но во всех обнаруженных нами мРНК с основной рамки считывания способенсинтезироваться белок, совпадающий по последовательности с полноразмерным белком SBR(здесь и далее это NP_524660.1 длиной 672 ак.) и отличающийся от него лишь точкой стартаили терминации трансляции.
Т.е. потенциально 19 выявленных транскриптов способны даватьначало 7 отличающимся белкам. Это было посчитано следующим образом: для каждоготранскрипта, начиная с 5’-конца, находили первый кодон AUG и смотрели на образующийсябелок при использовании этого кодона как старт-кодона. В большинстве случаев, первый илинесколько кодонов AUG приводили к образованию короткого пептида (это так называемые,uORF, подробнее о них – в разделе 4.1.2). Но неизменно один из первых кодонов AUGоказывался расположен «в рамку» с полноразмерным белком SBR. Подробнее о соотношениитранскриптов и потенциальных белков – в таблице 4.Таблица 4. Белки, которые потенциально могут быть закодированы в обнаруженныхтранскриптах гена sbr.
Различные неповторяющиеся типы белков выделены серым.Молекулярные массы рассчитаны с использованием сервиса Vitalonic Виталия Клименкова11. Впоследнем столбце указано, обнаружен ли такой белок экспериментально антителами к N- илиC-концу SBR; если участка связывания с антителом в белке нет, оставлен пропуск.Специфть дляорганаЕстьлиuORFСеменники:12.6++22.0++3Головы:1.9+-1) 71) 25; 2)10; 3) 3;4) 6; 5) 2;6) 24-4.9,4.7,4.7,4.5-+1) 7№ тр-та(Рис.
26)1, 2, 3, 411Длинатр-та,т.н.Сколько икакойдлиныпептидыкодируетuORF, акhttp://vitalonic.narod.ru/biochem/index.htmlРасчётнаямол.масса, кДаВыявленли белоквестернблотомАТ к N /АТ к С1-67276-137-67260+137-67260+1-327 + 5(кодируютсяинтроном 5)38Основная рамкаотносительнополноразмерногоSBR, ак++723.3,3.0,3.1,2.82.1,1.95, 6, 7, 89, 10-+1) 71-67276++1) 17; 2) 1242-67248-+1) 4; 2) 3;3) 278-67267---137-67260-+1) 71-67276--107-67264+1) 71-327 + 5(кодируютсяинтроном 5)38-+Яичники:2.3,+2.62.1,3, 4+2.42.8,3.1,5, 6, 7, 83.0,3,32.2,9, 10+2.54.9,11, 12,4.7,13, 144.7,4.5Для того, что ответить1, 2-+-+на вопрос, существуют ли такие белки на самом деле, первымшагом является проведение вестерн-блот анализа с белковыми пробами, выделенными изразных органов дрозофилы: семенников, голов и яичников.
Для этого мы использовалиантитела, полученные к С-терминальному фрагменту белка SBR, соответствующему экзону 9гена sbr, полученные Наталией Иванковой ранее (Ginanova et al. 2016), а также антитела кN-терминальному участку белка, получение которых описано в этой работе.3.9Идентификация белка SBR, кодируемого специфичными длясеменников транскриптамиКоммерческих антител к белку дрозофилы SBR не существует, поэтому дляидентификации белковых изоформ необходимо было получить антитела. Прежде всего,поскольку в тканях семенников количество транскриптов невелико, все они являютсяспецифичными для этого органа, один из них кодирует универсальный белок SBR, а остальные,по нашему предположению, – укороченный на 136 ак с N-конца белок, мы начали с анализабелков семенников.
Наталией Иванковой были получены антитела к С-терминальномуфрагменту белка SBR (Рис. 27, подчёркнуто), которые мы использовали в вестерн-блот анализедля того, чтобы определить, являются ли укороченные с 5’-конца семенниково-специфичныетранскрипты (№2 и 3 в Таблице 4) белок-кодирующими. В анализ были взяты образцытотального белка из разных органов дрозофил: яичников самок дикого типа, а также голов исеменниковсамцовдвухразныхгенотипов–FM6v, y sc8 dm B/Dp(1;Y) y+ v+иsbr12/Dp(1;Y) y+ v+. Вторые самцы интересны тем, что аллель гена sbr (sbr12), присутствующий в73гетерозиготном состоянии в их геноме, представляет собой делецию 30 н.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
