Диссертация (1145736), страница 11
Текст из файла (страница 11)
2006). mNXF7 локализуется исключительно в цитоплазматических гранулах ине принимает участия в экспорте мРНК (Tan et al. 2005), ассоциирован с активнымирибосомами, стресс-гранулами и Р-гранулами (Katahira et al. 2008), белком Staufen1 (Tretyakovaet al. 2005). Более того, как Mm nxf7, так и Hs nxf5, являясь функциональными аналогами,экспрессируютсяпреимущественновмозге,чтоделаетвероятнымихучастиевцитоплазматическом метаболизме мРНК в нейронах (Vanmarsenille et al. 2013).Таким образом, можно заключить, что белки семейства NXF вовлечены не только вэкспорт РНП гранул из ядра, но и сопровождают отдельные мРНК в цитоплазме.
Являясь РНКсвязывающимибелками,белкиNXFспособнывзаимодействоватьсразличными,специализированными для различных клеточных процессов мРНК, участвуя в регуляциисвоевременной и локализованной трансляции таких мРНК.45Глава 2 Материалы и методы2.1Линии D.melanogasterдикий тип:Oregon-Rsbr12:sbr12 (l(1)24/45) / FM6v, y sc8 dm BL4:Df(1)v-L4, ras2 mD / FM6l, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+Линии культивировали в стеклянных стаканах объёмом 50 мл на питательной среде«Изюмная» в термостате при температуре 25±0,5 °С, поверхность среды смазывали дрожжами.Поскольку мутация sbr12 в гомо- и гемизиготе приводит к летальному эффекту, дляполучения самцов-носителей аллеля sbr12 скрещивали самок линии sbr12 и самцов линии L4 иотбирали самцов с глазами дикого типа следующего генотипа: sbr12/Dp(1;Y) y+ v+ B+. Самцыsbr12/Dp(1;Y) y+ v+ несли дополнительный аллель sbr+, локализованный в Y-хромосоме.
Вэкспериментах для контроля использовали самцов FM6v, y sc8 dm B/Dp(1;Y) y+ v+, полученныхв том же скрещивании.Препарирование D. melanogaster осуществляли в 1х растворе PBS.2.25’ и 3’ RACE-PCR для определения концевыхпоследовательностей транскриптов гена Nxf1 D. melanogasterТотальная РНК из голов, семенников и яичников D.
melanogaster дикого типа (линияOregon-R) в возрасте 3-5 суток была выделена TRIzol Reagent (Invitrogen, США) по протоколупроизводителя. кДНК была получена с использованием набора Mint RACE cDNA amplificationset (Евроген, Россия). Для RACE-PCR (rapide amplification of cDNA ends) использовалиследующие праймеры, специфические для гена sbr (gene ID: 43944):Для образцов из семенников:РаундIIIIIIex7R1ex7R2ex6-7R5’ RACE-PCRCGAAGGCATTGATATGGAGAGCACAGATAGGATGCCTTCGTTCTCTCCGTCCAACTTAACCAex4Fex9F3’ RACE-PCRACTCTTGAGTGCTCTATTGGCAGGGTGGTGCCACAGAATAATGДля образцов из голов:ex7R1ex7R2ex5Rex4Rex2Rex1R5’UTRСм. вышеСм. вышеGATGGACAGATTGCGAAGCCGACATCGCTGCCAATAGACGCAAATCTTCGGGTCGCAGCTTGTTGTAACGTCCGCCGCCATTGTTGTGTGTTTGTGTGGGTGCTGTTIin5R3ACTTTGGACGAAGGCAACACCTGAIIin5R1in5R2AATATGCGGCAGCATCCACTAGGAATGGAGACAACAGAACAATGGAIIIex4RСм.
вышеIIIIIIex4Fex7FACTCTTGAGTGCTCTATTGGCAGTGCTCTCCATATCAATGCCTTCex10F3’UTRGGAGGAAACGAATTGGGACTTTGATTCCTAAGCCAAACACCTTCДля интрон-содержащих транскриптов:ex4ex5Fin5F-114in5F-763in5F1282ex7FСм. вышеAATCTGTCCATCTTGGAACTCGCCATTGTTCTGTTGTCTCCATTCCTTCGTGTCGCCGCTTGTTGATTAGCACCTAGTGCCTCTGCCTCTTСм. выше46ex5RСм. вышеВсе последовательности приведены в формате 5’-3’.
Все используемые в работепраймеры синтезированы компанией «Бигль», Россия.Параметры амплификации подбирали на основании рекомендаций производителя.Полученные мажорные однородные ПЦР-продукты (после второго или третьего раунда ПЦР),отсутствующие в контрольной реакции только с геноспецифическим праймером, выделяли изгеля, клонировали в вектор pAL-TA (Евроген, Россия) или pJet2.1 (Thermo Scientific, США),трансформировали E.coli, выделяли плазмиды из нескольких положительных клонов бактерий исеквенировали вставки на секвенаторе ABI Prism 3500 (Applied Biosystems, США).2.33’ RACE-PCR для определения концевых последовательностейтранскриптов гена Nxf1 M.
musculusЗамороженные в жидком азоте ткани M. musculus (ткань мозга, мышечная ткань бедра,семенник) были получены от Ольги Хуттунен (лаборатория генетической токсикологии, ФГУПГос. НИИ ОЧБ ФМБА России, СПб). Все протоколы описаны в предыдущем разделе.Для RACE-PCR использовали следующие праймеры, специфические для гена Mm nxf1(gene ID: 53319):Раунд3’ RACE-PCRIMm369F GCGGGAATTAGACAAGATAAAAGGGII369R_r_c CACAGCCTTTTCTAGAATCTCCCTAIIIMm_CTE GCCATCAGGAGAGAACTTGGG2.4ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскрипцией) с РНК, выделенной изсеменников, в качестве матрицыДля подтверждения результатов RACE-PCR на кДНК, полученной из тканейсеменников, и на кДНК, одновременно полученной из тканей головы тех же самцов, проводилисерию ПЦР с одинаковым обратным праймером в экзоне 5 (5’-GGGAACGGCAGGGATTGTTC)и тремя прямыми: #1 и #2 – в интроне 3 (5’-TATTATTGCTTACATCTACAGACGT и 5’GATAATTTCGGTCGCTGCTATCT), #3 – в экзоне 4 (5’-CAGCATGGAGGCGTTTAAGGG).Условия реакции: GoTaq® DNA Polymerase (Promega, США), 1 цикл 2 минуты при 95 °С, 35циклов по 30 секунд при 95 °С, 30 секунд при 51 °С и 1 минуте при 72 °С, 1 цикл 5 минут при72 °С, хранение при 4 °С.
Последовательности ампликонов, полученные с праймеров #1 и #2,были подтверждены секвенированием на ABI Prism 3500 (Applied Biosystems, США).2.5ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)Описание ПЦР-РВ приведено в соответствии с рекомендациями MIQE (MinimumInformation for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) (Bustin et al. 2009).47Оба ПЦР-РВ анализа, приведённые в работе, были повторены дважды на независимопрепарированных органах. Тотальная РНК из голов, семенников и яичников D. melanogasterдикого типа (линия Oregon-R) в возрасте 3-5 суток была выделена TRIzol Reagent (Invitrogen,США) по протоколу производителя и растворена в 20 мкл depc-H2O. Концентрацию РНКизмеряли на приборе NanoDrop 2000 (NanoDrop products, США), целостность РНК проверенаметодом капиллярного электрофореза на приборе MCE®-202 MultiNA Microchip ElectrophoresisSystem for DNA/RNA Analysis (Shimadzu Europa GmbH, Япония). РНК обрабатывали ДНКазойдля удаления остатков геномной ДНК из проб по протоколу производителя (DNaseI,«Fermentas»).
Образцы РНК хранили при -70 °С.5 мкг РНК, обработанной ДНКазой, брали в реакцию обратной транскрипции в объёме20 мкл(SuperScriptIIIReverseTranscriptase,Invitrogen,США)сослучайнымигексануклеотидами в качестве праймеров в концентрации 10 pM. Полученную кДНК хранилипри -20 °С.ПЦР-РВ были поставлены на приборе BioRad C1000 Touch с детектором флуоресценцииCFX96 Touch (BioRad, США) с флуоресцентным интеркалирующим агентом Power SYBR GreenPCR Master Mix (Applied Biosystems, США) по протоколу производителя. Необходимоеколичество матрицы на реакцию объёмом 25 мкл определяли в предварительной реакции с1 мкл кДНК по пороговому циклу.Для ПЦР-РВ использовали следующие праймеры:НазваниепраймераК генуsbr (Dm nxf1)(CG1664)ex9_F1ex9_R1ex4-5_Fex4-5_Rex5_Fin5_Rin5mid_Fin5mid_RЛокализацияПоследовательность праймераЭкзон9Экзон9Экзон4Экзон5Экзон5Интрон5Интрон5CACAGAATAATGGCTCTTGTATCCTGGTCACTGCACTGGAAGTCAGCATGGAGGCGTTTAAGGGGGGAACGGCAGGGATTGTTCAATCTGTCCATCTTGGAACTCGAATATGCGGCAGCATCCACTAGCACGCATGTAGCCACTCCACGПЦРпродуктп.н.ex9147ex4-5155ex5-in5136in5mid130Эф-тьПЦР%84857892Интрон5 СAAGCGGCGACACGACAATGК генутубулинаTub_FЭкзон2TGGGCCCGTCTGGACCACAAαTub84BTub84Tub_RЭкзон2TCGCCGTCACCGGAGTCCAT(CG1913)167Параметры амплификации: 1 цикл 10 минут при 95 °С, 40 циклов по 15 секунд при 95 °Си 1 минуте при 59 °С.
Для подтверждения отсутствия неспецифической амплификациипродукты ПЦР были проанализированы методом электрофореза в агарозном геле, а также послеокончания основной программы при каждом запуске прибора строили кривые плавления ПЦРпродуктов.48Эффективность ПЦР и отсутствие ингибирования реакции определяли путём постановки4 реакций с каждой парой праймеров на последовательно разведённой матрице (в 10 раз).Эффективность ПЦР в процентах вычисляли по графику, где по оси x откладывали десятичныйлогарифм разведения матрицы, а по оси y – Ct (threshold cycle– пороговый цикл), по формулеE=101/a, где a – тангенс наклона калибровочной прямой, описываемой уравнением y=-ax+b.Чтобы исключить возможность контаминации проб геномной ДНК, мы поставили ПЦРРВ по нашему протоколу с РНК в качестве матрицы (с этих РНК прежде была получена кДНК).Поскольку ДНК-полимераза не может производить синтез с РНК, амплификация в такихреакциях будет происходить только в случае присутствия в пробе ДНК.
Для всех наших пробрезультаты такой ПЦР были отрицательные.В предварительных экспериментах тестировали несколько референсных генов с разнойхромосомной локализацией: актин 42А – хромосома 2R (CG12051), тубулин – 3R (CG1913),Ef1α100E– 3R (CG1873), Gapdh2 – X (CG8893). Поскольку разницы в экспрессии исследуемогогена в разных органах при нормировке на разные референсные гены не наблюдалось, в работеприведены результаты анализа с референсным геном αTub84B. Метод определения Cq (то же,что и Ct в терминологии MIQE) – ΔΔCq, метод нормирования – на один референсный ген сучётом эффективности реакций по Michael W. Pfaffl (Pfaffl, 2001).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
