Диссертация (1145736), страница 6
Текст из файла (страница 6)
У дрозофилывсё наоборот: Dm nxf1 локализован в Х-хромосоме, а Nxf2-4 – в аутосоме (3L, 3L и 3R,соответственно).Второе отличие – неясные функции генов-паралогов Nxf1 дрозофилы. Dm NXF1 –основной фактор ядерного экспорта у D. melanogaster (Wilkie et al. 2001). Dm nxf2 и Dm nxf3тканеспецифичности не проявляют – они экспрессируются во всех тканях, но на гораздо болеенизком уровне, чем Dm nxf1 (Herold et al. 2001; Korey et al. 2001; Wilkie et al. 2001). Белки NXF23дрозофилы меньше похожи друг на друга (около 20% идентичности), чем белки этогосемейства у человека (более 40% идентичности) (Herold et al. 2000, 2001). Для Dm NXF2показана локализация в нуклео- и цитоплазме, но ассоциации с ядерной оболочкой необнаружено.
Также этот белок проявляет слабую аффинность к Nxt1 (в отличие от белков NXF2и NXF3 человека, которые при димеризации с p15 способны к экспорту). На структурномуровне домен LRR Dm NXF2 содержит дополнительные повторы (Herold et al. 2000, 2001). Чтокасается Dm NXF3, его UBA-like домен существенно изменён, однако с Nxt1 этот факторвзаимодействует. В белке Dm NXF4 нет NTF2-like домена (Herold, 2000) и UBA домена(Fribourg et al.
2001).В отсутствие Dm nxf1, Dm nxf2-4 не могут его заменить, даже в условияхсверхэкспрессии. Значит, эти факторы не участвуют в экспорте большинства клеточных мРНК.Нокдауны Dm nxf2-4 не имеют видимого фенотипа (Herold et al. 2001).Основным фактором экспорта мРНК из ядра у дрозофилы, как и у других животных,является ген Dm nxf1.1.2.4 Организация локуса Dm nxf1 у дрозофилы и мутации в этом локусеГен Dm nxf1 (Gene ID: 43944) длиной 14.341 п.н. состоит из 10 экзонов и 9 интронов(Рис. 6А).
Из-за существования предсказанных альтернативных промоторов в длинноминтроне 3 (составляет 62% гена) до 2001 года полагали, что ген Dm nxf1 начинается счетвёртого экзона (по Ivankova, 2010). В длинном интроне 3 расположены ещё три открытыерамки считывания: CG32669, CG15210, CG15209 (Рис. 6Б).
Все три гена являются белоккодирующими, их функция неизвестна (Таблица 1).Таблица 1. Открытые рамки считывания в интроне 3 гена Dm nxf1.Название гена Длина гена, п.н. Длина белка, ак Ориентация по отношению к Dm nxf1CG326692385604ПрямаяCG1521066669ПрямаяCG15209791147ОбратнаяДля гена CG32669 показана консервативность в таких организмах, как человек,шимпанзе, макак-резус, собака, кошка, мышь, крыса, курица, Danio rerio и лягушка (NCBI5,2016). Для белковых продуктов остальных двух генов в двугибридной системе при анализе всехбелок-белковых взаимодействий дрозофилы были показаны следующие взаимодействия: дляCG15210 – с Ef1alpha48D (Elongation factor 1alpha48D); для CG15209 – с продуктом генаCG14410, с LCP2 (Larval cuticle protein 2), RAF2 (RING-associated factor 2) (Giot et al. 2003).5https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene24Рисунок 6. Структура локуса, гена и транскрипта гена Dm nxf1.
А – интрон-экзонная структурагена Dm nxf1 и его полностью сплайсированный транкрипт; Б – структура локуса Dm nxf1 стремя открытыми рамками считывания в интроне 3 гена Dm nxf1.Полноразмерная полностью сплайсированная мРНК гена Dm nxf1 (NM_079921.3) имеетдлину 3280 н., 504 н. из которых принадлежат 5’UTR (untranslated region), 2019 н. –кодирующей области и 757 н. – 3’UTR (Рис. 6А). Помимо мРНК, из которой вырезаны всеинтроны, в базах данных фигурирует ещё один транскрипт гена Dm nxf1, он начинается c 488 н.экзона 4 (AY069415.1).Белок Dm NXF1 имеет длину 672 аминокислоты (NP_524660.1) и состоит из тех жедоменов, что и NXF1 человека (Рис.
7).Рисунок 7. Доменная структура белка Dm NXF1. Наверху приведена нумерация аминокислот всоответствии с Conserved Domain Database (CDD), NCBI6. Домены обозначены разнымицветами: RBD — RNA-binding domain; LRR — leucine-rich repeats; NTF2-like — nuclear transportfactor 2-like; UBA-like — ubiquitin-associated-like. Расположение сигнала ядерной локализации(NLS) дано по Zhang et al.
2011.Второе название гена Dm nxf1 – sbr, что расшифровывается как small bristles – короткиещетинки. Это связано с тем, что первая полученная по этому гену мутация, sbr1, затрагиваламакрохеты – сенсорные щетинки на голове и тораксе дрозофилы. Молекулярная природа аллеля6http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd25sbr1неизвестна,посколькусеквенированиеневыявилозначимыхизмененийпоследовательности ДНК в кодирующей части гена. Когда стало понятно, что этот локускодирует белок Dm NXF1, гомологичный TAP человека и Mex67p дрожжей (Korey et al. 2001),ген sbr получил своё второе название – Dm nxf1 – из-за принадлежности к эволюционноконсервативному семейству Nxf.
Далее в тексте мы будем называть ген Nxf1 дрозофилы sbr. Насегодняшний день известно 37 аллелей гена sbr, 14 из которых являются трансгенными исконструированы in vitro, а остальные получены путём мутагенеза. Большинство мутаций вгомо- или гемизиготе летальны, т.к. ген sbr является жизненно важным. Жизнеспособны толькогомозиготы sbr1 и sbr2 (FlyBase7, 2016). Ген sbr обладает плейотропным эффектом, т.е. влияет напроявление нескольких признаков (Табл.
2). Мутации по гену sbr приводят к нарушениямнервной системы, развития мышц, репродуктивной системы, расхождения хромосом иформирования веретена деления в митозе и мейозе, формирования щетинок и локомоторныхорганов. Некоторые из нарушений не удаётся объяснить нарушением известной функции sbr –ядерного экспорта мРНК.Таблица 2 Фенотипические проявления некоторых аллелей гена sbr. Выделены аллели сдоминантным проявлением.Аллельsbr16Фенотипкороткие щетинки, сниженнаяжизнеспособностьнарушение морфологии щетинок и крыльев,сниженная жизнеспособность и фертильностьсамцовнарушение формирования моторныхнейронов ISNb в эмбриогенезестерильности самцов и самокsbr17стерильность самцовsbr1sbr2sbr6sbr18, sbr19sbrmglnsbr5sbr10 (ts)sbr127http://flybase.orgредукция или отсутствие щетинок, ног,крыльевнарушение формирования мышц и моторныхнейронов ISNb в эмбриогенезепоявление трёхполюсных делений в мейозе Iу самокнарушение формирования долговременнойпамяти,нарушение расхождения половых хромосом вмитозе и мейозе Iнарушение формирования моторныхнейронов ISNb в эмбриогенезе,нарушения морфологии нервного ганглия,стерильность самцов, аномалии полового(Korey et al.
2001)FlyBase(Korey et al. 2001)(Geer et al. 1983)(Dybas et al. 1983; Geer et al.1983)FlyBase(Korey et al. 2001)(Golubkova et al. 2009)(Никитина и др. 2003б),(Никитина и др. 2003;Кьергаард и Мамон, 2007)(Korey et al. 2001),(Никулина 2011),(Голубкова и др. 2015)26поведения и двигательной активности самцов1.2.5 Известная функция sbr и результаты, не укладывающиеся в рамкиизвестной функцииНаблюдаемое внутриклеточное распределение белка SBR, а также доминантные, аллельспецифические эффекты, невозможно было объяснить универсальной функцией гена sbr. Окаких наблюдениях идёт речь?Прежде всего, белок SBR локализуется не только в ядре или вблизи ядерной оболочки,как это показано для его ортологов у млекопитающих (Bachi et al.
2000). SBR в ходесперматогенеза выявляется специфичными антителами в виде гранул как в ядре, так и вцитоплазме первичных сперматоцитов (Рис. 8Б), а также на постмейотической стадии округлыхсперматид (Ацапкина и др. 2010). В периоды оогенеза и эмбриогенеза распределение белка SBRтакже ставит вопрос о его функциях. В транскрипционно-неактивном ооците белок SBRнаходится только в цитоплазме, та же локализация характерна и для питающих клеток. Воплодотворённом яйце белок SBR распределён равномерно, а в период делений дробленияэмбриона находится в цитоплазме, маркируя области веретена деления (Рис.
8В). На всех этихстадиях транскрипции не происходит (Голубкова и др. 2015). Ещё одним подтверждениемнеканонической локализации белка NXF1 дрозофилы стало наблюдение за его распределениемв ходе нейрогенеза. У личинок первого возраста SBR маркирует реактивированныенейробласты и соседние с ними клетки нервного ганглия, а у личинок третьего возрасталокализуется в отдельных нейробластах и их потомках и во всём нейропиле в целом (т.е.
вотростках нейронов, занимающих центральную область ганглия) (Рис. 8А) (Yakimova et al.2016).27Рисунок 8. Цитоплазматическая локализация белка SBR (Dm NXF1). Панели организованысверху вниз: на первом изображении окраска ДНК DAPI, на втором – антителами к SBR, натретьем – совмещение изображений. А – срез через полусферы нервного ганглия личинкитретьего возраста; SBR локализован в центральной части ганглия – в нейропиле,сформированном отростками нейронов; масштаб 100 мкм (Yakimova et al.
2016); Б – первичныесперматоциты зачатка семенника самца дрозофилы на стадии предкуколки; SBR присутствуеткак в ядре, так и в цитоплазме в виде гранул; стрелкой отмечена гранула SBR на поверхностиядра, предположительно маркирующая центросому; масштаб 10 мкм (Ацапкина и др. 2010); В –эмбрион дрозофилы на ранней стадии развития; SBR присутствует в цитоплазме и маркируетверетёна деления; масштаб 75 мкм (Голубкова и др. 2015).Помимо распределения белка SBR в различных органах и на разных стадиях развития внорме, существует ряд мутантных проявлений, также не согласующихся с тем, что ядерныйэкспорт – единственная функция гена sbr.Самцы, гетерозиготные по аллелю sbr12, стерильны и не содержат в семенникахподвижных сперматозоидов (Касаткина, 2007; Голубкова и др.
2015). Поскольку ген sbr28локализован в Х-хромосоме, и мутация sbr12 в гомо- и гемизиготе приводит к летальномуэффекту, для получения самцов-носителей аллеля sbr12 в их Y-хромосому введена дупликация сфункциональным аллелем sbr. Нарушения у самцов с sbr12 аллель-специфичны и доминантны,т.е. нормальный белок, присутствуя наряду с мутантным, не способен обеспечитьформирование функциональных сперматозоидов. У мутантных самцов на стадии удлинениясперматид нарушен цитокинез, часто встречаются цисты с клетками различной морфологии,можно видеть дефекты аксонемы, митохондриального производного (Рис. 9) (Голубкова и др.2015).
Спермиогенез протекает в отсутствии транскрипции мРНК за счёт трансляции ранеезапасённых и временно нетранслируемых мРНК, значит, экспортная функция SBR на данномэтапе не нужна, она была востребована ранее.Рисунок 9. Поперечный срез цисты из 64 клеток на стадии удлинения сперматид самцовдрозофилы, гетерозиготных по мутации sbr12. Электронная микроскопия. Заметны дефектыаксонемы (указаны стрелкой), ненормальная вариабельность в размерах большого и малогопроизводных митохондрий, сперматиды часто не разделены на отдельные клетки; масштаб 200и 500 нм, соответственно (Голубкова и др. 2015).Характернойособенностьюнекоторыхмутантовпогенуsbrявляетсягаплонедостаточность – явление, при котором мутантный аллель отчетливее проявляется не вгомозиготном состоянии, а в гемизиготе – если мутация представлена в одной дозе.
Такоепроявление описано для аллеля sbr1: отсутствие отдельных щетинок или их укорочение иутончение выражены больше, когда мутация sbr1 у самок представлена в одной дозе на фонеделеции, удаляющей участок хромосомы с геном sbr (Korey et al. 2001). Гаплонедостаточностьхарактерна и для аллеля sbr10 (l(1)ts403), когда он у самок представлен в компаунде с нулевымаллелем (Голубкова и др. 2004; Golubkova et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
