Диссертация (1145736), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

2011). Давший названиесемейству ген Nxf1 у разных организмов отвечает за транспорт большинства мРНК из ядра вцитоплазму (Herold et al. 2003). Эта универсальная функция необходима всем клеткам сактивной транскрипцией. Функциональная организация белка NXF1 позволила назвать еготранспортным рецептором мРНК, поскольку как рецептор он через белки-адаптерывзаимодействует с клеточными мРНК, а как транспортёр, благодаря взаимодействию снуклеопоринами, обеспечивает перенос РНП комплекса через ядерные поры (Katahira et al.1999; Bachi et al. 2000; Fribourg et al. 2001; Lévesque et al. 2001; Schmitt and Gerace 2001;Thakurta et al. 2004; Viphakone et al.

2012). У Drosophila melanogaster ортологом гена Nxf1других организмов является ген small bristles (sbr) или Dm nxf1 (Wilkie et al. 2001; Herold et al.2001; Tretyakova et al. 2001).Большинство известных аллелей гена sbr летальны в гомо- или гемизиготном состоянии(FlyBase1, 2016). Мутации гена sbr характеризуются широким спектром плейотропныхэффектов, среди них некоторые проявляются доминантно: нерасхождение хромосом в митозе имейозе, мужская стерильность, нарушения морфологии нервного ганглия, формированиядолговременной памяти и моторных нейронов в эмбриогенезе (Dybas et al.

1983; Geer et al.1983; Korey et al. 2001; Никитина и др. 2003, 2003б; Golubkova et al. 2009; Никулина 2011;Голубкова и др. 2015). Аллель-специфичные проявления признаков могут отражатьэволюционное усложнение гена sbr, при котором произошло объединение несколькихэлементарных функций, как это часто случается у наиболее древних генов (Long et al.

2003), аопределённые мутации могут нарушать отдельные функции, не затрагивая остальные. Явлениеплейотропии широко исследуют в медицине: для разработки терапии наследственныхзаболеваний, связанных с плейотропными генами, важно определить, возможно ли направленновоздействовать лишь на одну из функций гена, не затрагивая остальные. Исследованиемеханизмов тканеспецифичности экспрессии гена sbr поможет ответить на этот вопрос.В медицинской генетике известны ассоциации генов семейства Nxf с умственнойотсталостью, психомоторными нарушениями и возникновением патологических синдромов.Например, у некоторых пациентов с Х-сцепленной умственной отсталостью описана потеряэкспрессии гена NXF5 и мутации в гене NXF2 (Frints et al.

2003). Делеция части кластера геновNXF на Х-хромосоме связана с тяжёлой формой умственной отсталости и целым спектром1http://flybase.org6синдромных нарушений (Grillo et al. 2010), как и дупликация с нарушением генного кластера(Chen et al. 2011). Ген NXF3 является геном-кандидатом, вызывающим олигозооспермию(снижение количества сперматозоидов в сперме) (The Human Gene Mutation Database2, 2016).Гены-паралоги Nxf1 у млекопитающих (NXF2, NXF3, NXF5 человека, Nxf2, Nxf3, Nxf7 мыши)демонстрируют те же особенности, что и ген sbr (Dm nxf1) дрозофилы: тканеспецифичнуюэкспрессию, цитоплазматическую локализацию, отличные от ядерного экспорта функции.Поскольку все белки семейства NXF обладают сходной доменной структурой, закономерности,выявленные для изоформ белка NXF1 дрозофилы известной доменной структуры, могут бытьраспространены на белки млекопитающих.Для экспрессии и регуляции генов дрозофилы характеры все те же механизмы, что и длягеновмлекопитающих.Поэтомуизучениерегуляциигенаsbrдрозофилыимеетобщебиологическое значение, расширяя наши знания о различных способах организациимолекулярных систем транскрипции, трансляции, экспорта и хранения мРНК.

ИспользованиеD. melanogaster как модельного объекта позволяет оценивать системную реализациюэкспрессии генов. Это очень важно, поскольку при исследовании клеточных процессов in vivoна культуре клеток пропадает важный аспект, связанный с дифференциальной реализациейгенетической информации в разных органах и тканях. Когда мы говорим о генетике животных,речьидётодинамическомпроцессеразвитияорганизмаотоднойклеткидосложноорганизованной особи, который отличает высших эукариот от одноклеточныхорганизмов.

Акцент делается на формировании в ходе развития разных систем органов, прикоторомогромныйгеномэукариот,полныйрегуляторныхпоследовательностей,экспрессируется по различным программам в зависимости от органа, ткани или периодаразвития.ПоэтомувыявленныеdenovoтканеспецифичныетранскриптыибелкиD. melanogaster становятся новыми игроками в процессах развития и функционированииразличных органов и систем.Степень разработанности темы исследованияВ соответствии со статистикой на ~20.000 генов человека, кодирующих белок, приходится~80.000 транскриптов (Human GENCODE Release (version 25)3, 2016). На основе данныхRNA-seq от 95 до 100% генов человека кодируют 2 и более транскрипта (Lee and Rio 2015).Альтернативный сплайсинг является важным механизмом регуляции экспрессии генов иувеличения разнообразия транскриптома и протеома. В результате белки, кодируемые однимгеном и различающиеся по последовательности и/или структуре, могут иметь различныесвойства и функции (Stamm et al, 2005).

Альтернативный сплайсинг – это только один тип23http://www.hgmd.cf.ac.uk/achttp://www.gencodegenes.org/stats/current.html7событий альтернативной транскрипции, не менее значимы альтернативная инициациятранскрипции и альтернативное полиаденилирование. Транскрипты около 70% генов человекаимеют 3'UTR (untranslated region – нетранслируемая область от стоп-кодона до концатранскрипта) разной длины (Djebali et al. 2012), что позволяет по-разному регулироватьэкспрессию одного и того же гена на пост-транскрипционном уровне (Lianoglou et al. 2013).Альтернативное полиаденилирование, изменяющее кодирующую область гена, влияет наэкспрессию гена качественно: приводит к синтезу новых белковых изоформ, а альтернативноеполиаденилирование, затрагивающее 3’UTR – количественно (Di Giammartino et al.

2011).Инициация транскрипции большинства генов также происходит на разных участках взависимости от ткани (de Klerk and 't Hoen, 2015). После широкого распространения методоввысокопроизводительного секвенирования генома и транскриптома мы знаем, какиетранскрипты синтезируются в той или иной ткани, но часто не понимаем, из-за чего такпроисходит.

Отдельные механизмы тканеспецифичной регуляции показаны лишь при болеедетальном анализе и переходе от полногеномного уровня к уровню индивидуальных генов исетей их взаимосвязи. Поэтому исследование продуктов альтернативной транскрипцииэволюционно древнего гена, ответственного за ядерный экспорт мРНК у эукариот от дрожжейдочеловека,способствуетфундаментальному пониманиюмеханизмов формированияспециализированных молекулярных функций за счёт альтернативных продуктов гена.Известно, что для гена sbr (Ivankova et al.

2010), как и для многих генов Nxf1 другихорганизмов (позвоночных и беспозвоночных) (Мамон и др, 2013; Mamon et al. 2013),характерным типом альтернативного сплайсинга является сохранение гомологичного интрона.Хотя биогенез мРНК с сохранёнными интронами исследуется уже много лет, молекулярныемеханизмы невырезания интрона и связь между ядерным экспортом и трансляцией таких мРНКдо сих пор остаются непонятными (Li et al.

2016).Цельданнойработы–определениепоследовательностиорганоспецифичныхтранскриптов гена sbr D. melanogaster и поиск соответствующих транскриптам белковыхпродуктов.Задачи:определитьиспользуемыеточкистартатранскрипцииисайтыполиаденилирования в альтернативных транскриптах гена sbr в тканях головы, семенников ияичников дрозофилы; количественно оценить содержание транскриптов с включениемразличныхучастковгенаsbr;проверитьгипотезуосуществованиитранскриптов,заканчивающихся в интроне 5 гена sbr (Dm nxf1) дрозофилы и гомологичном интроне 10 Nxf1мыши;8с использованием антител к С-терминальному участку белка SBR провестивестерн-блот анализ белковых проб из различных органов дрозофилы для поиска новыхбелковых изоформ;получить поликлональные кроличьи антитела к N-терминальному участку белкаSBR, доказать их специфичность в отношении белка SBR; провести вестерн-блот анализ белковиз различных органов дрозофилы для поиска новых белковых изоформ и определить,существует ли их органоспецифичность.Научная новизнаВ ходе анализа 5’- и 3’-концевых последовательностей мРНК гена sbr были впервыевыявленыальтернативныеточкистартатранскрипцииииспользуемыесайтыполиаденилирования, проведена сборка всех вероятных транскриптов и описана специфичностьих экспрессии в зависимости от органа.

Также впервые были выявлены и охарактеризованы дверазные короткие изоформы белка SBR – SBR-t (семенниково-специфичная) и SBR-ir(соответствующая интрон-содержащему транскрипту).Теоретическая и практическая значимостьИзучение тканеспецифичных продуктов эволюционно консервативного гена Nxf1D. melanogasterвноситвкладвфундаментальноепредставлениеоспособахираспространённости тканеспецифичной регуляции экспрессии генов; ставит вопрос о ролипродуктов гена Nxf1 в функционировании нервной системы и формировании мужских половыхпродуктов; демонстрирует связь между процессами транскрипции, экспорта мРНК итрансляции через участие РНК-связывающих белков в этих процессах.

Кроме того,обнаружение белка, транслируемого с интрон-содержащего транскрипта, вносит важный вкладв изменение представлений о механизмах реализации генетической информации. Вариантальтернативного сплайсинга с сохранением интрона считался у животных самым минорнымвариантом (Sugnet, 2004), поскольку хорошо было известно, что экспорт из ядра мРНК,содержащих интроны, ограничен (Chang and Sharp 1989; Legrain and Rosbash 1989;Hammarskjold 1997), и что мРНК с преждевременными стоп-кодонами подвергаютсядеградации NMD (nonsense-mediated mRNA decay) в цитоплазме (Maquat, 1995). Продукциюбелков с таких транскриптов не принято было анализировать. В настоящее время появляетсявсё больше данных о том, что сохранения интрона – распространённое событие в клеткахмлекопитающих (Li et al.

2016). мРНК, в которых сохраняется интрон, обнаружены придифференцировке гранулоцитов (Wong et al. 2013) и эритроцитов (Edwards et al. 2016; Pimentelet al. 2016). Также мРНК с сохранённым интроном распространены во многих раковых клетках(Dvinge and Bradley 2015).9Полученные в работе результаты служат примером дивергенции и, как следствие,перехода от универсальной к специализированной функции альтернативных продуктов одногогена, а также свидетельствуют об эволюционном многообразии путей реализации аналогичныхзадач в генных семействах млекопитающих и дрозофилы на молекулярном уровне.Все описанные закономерности могут быть использованы в молекулярно-генетическихкурсах как иллюстративный материал.Методология и методы исследованияВ работе использованы методы: RACE-PCR, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени, overlapextension ПЦР, дизайн олигопептидов для получения поликлональных кроличьих антител, ихконъюгирование, иммунизация животных, анализ сывороток в ИФА и при помощи вестернблот анализа, получение рекомбинантных белков дрозофилы в E.

Характеристики

Список файлов диссертации