Автореферат (1145735)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

На правах рукописиГинанова Виктория РинатовнаРазнообразие и тканеспецифичность продуктовгена Nxf1(nuclear export factor 1) Drosophila melanogaster,главного фактора ядерного экспорта мРНКСпециальность: 03.02.07 – генетикаАвторефератдиссертации на соискание учёной степеникандидата биологических наукСанкт-Петербург20172Работа выполнена в Федеральном государственномбюджетномобразовательном учреждении высшего образования "Санкт-Петербургскийгосударственный университет" на кафедре генетики и биотехнологиибиологического факультетаНаучный руководитель:Мамон Людмила Андреевна, д.б.н., ст.н.с., профессоркафедры генетики и биотехнологии Санкт-Петербургскогогосударственного университетаОфициальные оппоненты:Саранцева Светлана Владимировна, д.б.н., заместительдиректора по научной работе в НИЦ «Курчатовскийинститут» ФГБУ «Петербургский институт ядернойфизики им.

Б. П. КонстантиноваКиселёв Антон Вячеславович, к.б.н., старший научныйсотрудник в лаборатории пренатальной диагностикиФГБНУ НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологииим. Д. О. ОттаВедущая организация:Федеральное государственное бюджетное учреждениенауки «Институт цитологии» РАНЗащита диссертации состоится2017 г. вчасов на заседаниисовета Д.212.232.12. по защите докторских и кандидатских диссертаций приСанкт-Петербургском государственном университете по адресу:199034 Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, СПбГУ, биологическийфакультет, кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М.

ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета и на сайте СанктПетербургского государственного университета(https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/KkkBLkC99w.pdf)Автореферат разослан ___________________ 2017 г.Председательдиссертационного совета Д.212.232.12С. Г. Инге-Вечтомов3Общая характеристика работыАктуальность темы исследованияСемейство генов Nxf эволюционно консервативно, его представители есть уэукариот групп Fungi и Metazoa – от дрожжей до человека (Serpeloni et al. 2011).

Давшийназвание семейству ген Nxf1 отвечает за транспорт большинства мРНК из ядра вцитоплазму (Herold et al. 2003). Эта универсальная функция необходима всем клеткам сактивной транскрипцией. У Drosophila melanogaster ортологом гена Nxf1 другихорганизмов является ген small bristles (sbr) или Dm nxf1 (Wilkie et al. 2001; Herold et al.2001; Третьякова и др. 2001).Большинство известных аллелей гена sbr летальны в гомо- или гемизиготномсостоянии (FlyBase1, 2016).

Мутации гена sbr характеризуются широким спектромплейотропных эффектов, среди них некоторые проявляются доминантно: нерасхождениехромосом в митозе и мейозе, мужская стерильность, нарушения морфологии нервногоганглия, формирования долговременной памяти и моторных нейронов в эмбриогенезе(Dybas et al. 1983; Geer et al. 1983; Korey et al. 2001; Никитина и др. 2003, 2003б;Golubkova et al. 2009; Никулина 2011; Голубкова и др. 2015). Изучение плейотропииважно для медицины, чтобы разрабатывать подходы к направленному воздействию лишьна одну из функций гена, без изменения остальных.В медицинской генетике известны ассоциации генов семейства Nxf с умственнойотсталостью, психомоторными нарушениями и возникновением патологическихсиндромов.

Также ген NXF3 является геном-кандидатом, вызывающим олигозооспермию(снижение количества сперматозоидов в сперме) (The Human Gene Mutation Database2,2016). Гены-паралоги Nxf1 у млекопитающих (NXF2, NXF3, NXF5 человека, Nxf2, Nxf3,Nxf7 мыши) демонстрируют те же особенности, что и ген sbr (Dm nxf1) дрозофилы:тканеспецифичную экспрессию, цитоплазматическую локализацию белка, отличные отядерного экспорта функции, что нехарактерно для гена NXF1 человека. Поскольку всебелки семейства NXF обладают сходной доменной организацией, закономерности,выявленные для изоформ белка NXF1 дрозофилы с изменённой доменной структурой,могут быть распространены на белки семейства NXF млекопитающих.Степень разработанности темы исследованияНа ≈20.000 генов человека, кодирующих белки, приходится ≈80.000 транскриптов(Human GENCODE Release (version 25)3, 2016).

На основе данных RNA-seq 95-100%генов человека кодируют 2 и более транскрипта (Lee and Rio 2015). Альтернативныйсплайсинг является важным механизмом регуляции экспрессии генов и увеличенияразнообразия транскриптома и протеома. В результате белки, кодируемые одним геном иразличающиеся по последовательности и/или структуре, могут иметь различныесвойства и функции (Stamm et al. 2005). Не менее значимыми событиями являютсяальтернативная инициация транскрипции и альтернативное полиаденилированиетранскрипта. Тканеспецифичность альтернативных транскриптов известна, однако еёмеханизмы зачастую неясны.

Поэтому исследование продуктов альтернативнойтранскрипции эволюционно древнего гена Nxf1, наиболее изученной функцией которогоявляется ядерный экспорт мРНК у эукариот от дрожжей до человека, способствуетпониманию фундаментальных механизмов формирования специализированныхмолекулярных функций за счёт альтернативных продуктов гена.1http://flybase.orghttp://www.hgmd.cf.ac.uk/ac3http://www.gencodegenes.org/stats/current.html24Известно, что для гена sbr (Ivankova et al. 2010), как и для генов Nxf1 другихорганизмов (позвоночных и беспозвоночных) (Мамон и др. 2013), характерным иэволюционно консервативным вариантом альтернативного сплайсинга являетсясохранение гомологичного интрона.

Хотя биогенез мРНК с сохранёнными интронамиисследуется уже много лет, молекулярные механизмы появления функциональныхтранскриптов с невырезанным интроном, а также связь между ядерным экспортом итрансляцией таких мРНК до сих пор остаются непонятыми (Li et al. 2016).Теоретическая и практическая значимостьИзучение тканеспецифичных продуктов эволюционно консервативного гена Nxf1D. melanogaster вносит вклад в фундаментальное представление о способах ираспространённости тканеспецифичной регуляции экспрессии генов; ставит вопрос ороли продуктов гена Nxf1 в функционировании нервной системы и формированиимужских половых продуктов; демонстрирует связь между процессами транскрипции,экспорта мРНК и трансляции через участие в этих процессах РНК-связывающих белков.Кроме того, обнаружение белка, который транслируется с интрон-содержащеготранскрипта, вносит важный вклад в понимание роли белок-некодирующихпоследовательностей в реализации генетической информации.

Полученные в работерезультаты служат примером перехода от универсальной к специализированнымфункциям за счёт альтернативных продуктов одного гена.Цель данной работы – определение последовательности органоспецифичныхтранскриптов гена sbr D. melanogaster и поиск белковых продуктов, соответствующихальтернативным транскриптам.Задачи:определить используемые точки старта транскрипции и сайтыполиаденилирования в альтернативных транскриптах гена sbr в тканях головы,семенников и яичников дрозофилы; количественно оценить содержание транскриптов свключением различных участков гена sbr; проверить гипотезу о существованиитранскриптов, заканчивающихся в интроне 5 гена sbr (Dm nxf1) дрозофилы игомологичном интроне 10 Nxf1 мыши;с использованием антител к С-терминальному участку белка SBR провестивестерн-блот анализ белковых проб из различных органов дрозофилы для поиска новыхбелковых изоформ;получить поликлональные кроличьи антитела к N-терминальному участкубелка SBR, доказать их специфичность в отношении белка SBR; провести вестерн-блотанализ белков из различных органов дрозофилы для поиска новых белковых изоформ иопределить, существует ли их органоспецифичность.Научная новизнаВ ходе анализа 5′- и 3′-концевых последовательностей мРНК гена sbr быливпервые выявлены альтернативные точки старта транскрипции и используемые сайтыполиаденилирования, определена первичная последовательность всех вероятныхтранскриптов и специфичность их экспрессии в зависимости от органа.

Впервые быливыявлены и охарактеризованы два разных коротких белка SBR – SBR-t (“testes”,семенниково-специфичный) и SBR-ir (“intron retention”, соответствующий интронсодержащему транскрипту).Методология и методы исследованияВ работе использованы методы: RACE-PCR, ОТ-ПЦР, ПЦР в реальном времени,overlap extension ПЦР, вестерн-блот анализ белков, выделенных из разных органовдрозофилы, дизайн олигопептидов для получения поликлональных кроличьих антител,их конъюгирование c БСА (бычьим сывороточным альбумином), иммунизация5животных, анализ сывороток в ИФА (иммуноферментном анализе) и вестерн-блотанализе, получение рекомбинантных белков дрозофилы в E.

coli.Положения, выносимые на защитуГен sbr (Dm nxf1) у D. melanogaster помимо известной универсальной функции –участия в ядерном экспорте различных мРНК – выполняет органоспецифичныеспециализированные функции. В основе специализации функций гена sbr могут лежатьмолекулярные процессы, приводящие к возникновению органоспецифичныхтранскриптов и белковых продуктов этого гена. Выявлены альтернативные транскриптыгена sbr, некоторые из них встречаются только в семенниках, или в тканях головы, или вяичниках.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации