Автореферат (1145735), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Транскрипты гена sbr с сохранённым интроном в тканях головы дрозофилысоставляют значительную часть всех транскриптов гена, тогда как в семенникахD. melanogaster они представляют минорную фракцию; то же характерно и для интронсодержащих транскриптов гена-ортолога sbr – Mm nxf1 – в семенниках мыши. Вяичниках и тканях головы D. melanogaster идентифицирован новый белок SBR-ir (1-327+ 5 ак), который транслируется с транскрипта, сохраняющего интрон. Исходя изпоследовательности транскрипта, в белке SBR-ir отсутствуют домены, необходимые длясвязи с кофактором Nxt1 и нуклеопоринами.
В семенниках D. melanogaster обнаруженещё один новый белок – SBR-t (137-672 ак), который синтезируется с транскриптов,начинающихся в интроне 3. В коротком семенниково-специфичном белке SBR-t посравнению с полноразмерным SBR отсутствует N-терминальная часть белка с сигналомядерной локализации, что предполагает функционирование SBR-t в цитоплазме.Поскольку все три изоформы белка SBR сохраняют РНК-связывающие домены,укороченные белки SBR, по-видимому, участвуют в метаболизме и регуляции особыхмРНК, сохраняя с ними связь в цитоплазме в составе РНП комплексов.Степень достоверности и апробация результатовДостоверность результатов подтверждает их воспроизводимость в независимыхэкспериментах.
По материалам диссертации опубликовано 17 работ (14 тезисов и 3статьи) в реферируемых научных журналах и коллективной монографии. Изложенные вдиссертации результаты были представлены на 11 конференциях, из которых 6проходили в России, и 5 – за рубежом.Глава 1Обзор литературыГлавный ген Nxf1, давший название семейству Nxf, у разных организмов отвечаетза транспорт большинства мРНК из ядра в цитоплазму (Herold et al. 2003). Доменнуюорганизацию белка NXF1 удобнее всего рассмотреть на примере белка человека(Hs NXF1, TAP) (Рис. 1).
N-терминальная часть включает в себя сигнал ядернойлокализации – NLS (Kang and Cullen, 1999), РНК-связывающий домен (RBD – RNAbinding domain) и домен лейцин-богатых повторов (LRR – leucine-rich repeat) для белокбелковых взаимодействий. С-терминальная часть TAP состоит из двух доменов: NTF2like (похожий на фактор ядерного транспорта NTF2 – nuclear transport factor 2) и UBA(ubiquitin associated - взаимодействующий с убиквитином). Домен NTF2-like необходимдля взаимодействия TAP с белком p15 (Nxt1); без димеризации NXF1/Nxt1 экспортмРНК невозможен.
Для связывания с нуклеопоринами необходимы оба домена: NTF2like (обязательно с р15) и UBA (Braun et al. 2002).У Drosophila melanogaster ортологом гена Nxf1 других организмов является ген sbr(small bristles) (второе название Dm nxf1). Роль остальных генов Nxf дрозофилынеизвестна: в отсутствие Dm nxf1, гены-паралоги Dm nxf2-4 не могут заменить егофункцию; нокдауны Dm nxf2-4 не имеют видимого фенотипа (Herold et al. 2001).6Рисунок 1. Доменная организация белка TAP (Hs NXF1) (по Braun et al.
2001; Matzat etal. 2008; Li et al. 2016).Мутации гена sbr характеризуются широким спектром плейотропных эффектов.Большинство известных аллелей гена sbr летальны в гомо- или гемизиготном состоянии(FlyBase4, 2016). Некоторые проявления мутантного фенотипа не удаётся объяснитьнарушением известной функции sbr – ядерного экспорта мРНК. Например, самцы,гетерозиготные по аллелю sbr12, стерильны и не содержат в семенниках подвижныхсперматозоидов (Касаткина, 2007; Голубкова и др., 2015). У мутантных самцов на стадииудлинения сперматид нарушен цитокинез, часто встречаются цисты с клеткамиразличной морфологии, можно видеть дефекты аксонемы, митохондриальногопроизводного (Голубкова и др., 2015). Присутствие термочувствительного аллеля sbr10даже на фоне аллеля дикого типа в условиях теплового шока приводит к нерасхождениюхромосом в мейозе у самок (Никитина и др., 2003), а при пермессивной температуреаллель sbr10 в одной дозе оказывает на самок сильнейший стерилизующий эффект(Голубкова и др., 2004) из-за ранней эмбриональной смертности потомков таких самок.Гибель эмбрионов происходит по причине асинхронности протекания первых деленийдробления, нарушений морфологии ядра и расхождения хромосом (Golubkova et al.2006).
Плейотропные эффекты мутантных аллелей гена sbr заставляют задуматься ополифункциональности этого гена.У млекопитающих белок NXF1 локализуется, как правило, в ядре или вблизиядерной оболочки (Bachi et al. 2000). Для белка SBR это не всегда так. В ходесперматогенеза SBR выявляется в виде гранул как в ядре, так и в цитоплазме первичныхсперматоцитов и округлых сперматид (Ацапкина и др. 2010).
В период оогенеза втранскрипционно неактивном ооците белок SBR локализуется только в цитоплазме. Воплодотворённом яйце белок SBR распределён равномерно, а в период деленийдробления эмбриона находится в цитоплазме, маркируя области веретена деления. Вооцитах и ранних эмбрионах дрозофилы транскрипция не происходит и, соответственно,потребности в ядерном экспорте мРНК нет (Голубкова и др., 2015).
В нервной системеличинок первого возраста SBR маркирует реактивированные нейробласты и соседние сними клетки нервного ганглия, присутствуя как в ядре, так и в цитоплазме, а у личиноктретьего возраста – отдельные нейробласты и их потомки и весь нейропиль в целом (т.е.отростки нейронов, занимающих центральную область ганглия) (Yakimova et al. 2016).Основное отличие гена sbr от его ортологов у млекопитающих заключается вбольшем полиморфизме его продуктов.
Если для Nxf1 человека и мыши описан всегоодин вариант альтернативного сплайсинга (с сохранением интрона 10), то для sbrвариантов альтернативных транскриптов, как минимум, три (Рис. 2) (Ivankova et al.2010).Транскрипт 3.0-3.5 т.н. соответствует известной мРНК sbr – 3280 н. (Wilkie et al.2001).
Транскрипт 3.5 т.н. представлен во всех тканях кроме семенников, поэтомузакономерно называть его универсальным. Остальные транскрипты органоспецифичны.4http://flybase.org7Рисунок 2. Результаты нозерн-блот гибридизации тотальнойРНК, выделенной из разных тканей D. melanogaster, с зондомAJ318090.I (фрагмент кДНК sbr) (по Ivankova et al.
2010).В семенниках D. melanogaster выявлено 2 транскриптагена sbr длиной 1.9 т.н. и 2.8 т.н. Оба транскрипта корочеполноразмерного. Транскрипт 2.8 т.н. в семенниках являетсяаналогом универсального транскрипта и отличается от неготем, что укорочен с 3′-конца. Для второго транскрипта 1.9 т.н.также наблюдается укорочение 3′UTR. Помимо этого,инициация его транскрипции предположительно происходитна альтернативном промоторе в интроне 3 (Ivankova et al.2010).Гдезаканчиваютсясеменниково-специфичныетранскрипты и где начинается укороченный семенниковоспецифичный транскрипт 1.9 т.н., определено не было.Нейроспецифичный транскрипт 5.1 т.н. длиннее универсального, т.к.
в нём в ходеальтернативного сплайсинга сохраняется интрон 5 длиной 1602 н. (Ivankova et al. 2010).Аналогичный вариант сплайсинга известен для транскриптов генов Nxf1 мыши, человека(Sasaki et al. 2005; Li et al. 2006), Danio rerio (Wang et al. 2015) и других видов животных,поскольку в базах данных (FlyBase, Genbank, UCSC Genome) есть сведения об ESTs(Express Sequence Tags), включающих последовательности сохраняемого интрона исмежного с ним экзона (Мамон и др. 2013). Сохранение гомологичного интрона втранскриптах Nxf1 самых разных организмов (от нематоды до человека), а также тотфакт, что транскрипты с сохранённым интроном кодируют белок (показано для человекаи мыши (Li et al.
2006; Li et al. 2016), предполагают функциональную значимость этоговарианта альтернативного сплайсинга для генов Nxf (Мамон и др. 2013).Глава 2Материалы и методыЛинииD. melanogaster:Oregon-R,sbr12 (l(1)24/45) / FM6v, y sc8 dm B,Df(1)v-L4, ras2 mD / FM6l, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+.5′ и 3′ RACE-PCR для определения концевых последовательностей транскриптовгенов Nxf1 D. melanogaster и M. musculus. Из замороженных в жидком азоте тканейM. musculus (ткани мозга, мышечная ткань бедра, семенник) и голов, семенников ияичников D.
melanogaster дикого типа (линия Oregon-R) в возрасте 3-5 суток былавыделена тотальная РНК (TRIzol Reagent, Invitrogen, США), получена кДНК (Mint RACEcDNA amplification set, Евроген, Россия). Праймеры для генов sbr (gene ID: 43944) иMm nxf1 (gene ID: 53319), синтезированы компанией «Бигль» (Россия).ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Описание ПЦР-РВ приведено в соответствиис рекомендациями MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-TimePCR Experiments) (Bustin et al. 2009).
Была выделена тотальная РНК (TRIzol Reagent,Invitrogen, США), определена её концентрация (NanoDrop 2000, NanoDrop products,США), проверена целостность (MCE®-202 MultiNA Microchip Electrophoresis System forDNA/RNA Analysis, Shimadzu Europa GmbH, Япония), синтезирована кДНК (SuperScriptIII Reverse Transcriptase, Invitrogen, США).
ПЦР-РВ поставлены на приборе BioRadC1000 Touch с детектором флуоресценции CFX96 Touch (BioRad, США) сфлуоресцентным интеркалирующим агентом Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems, США). Метод определения Cq – ΔΔCq, метод нормирования – нареференсный ген с учётом эффективности реакций (Pfaffl, 2001). Каждая реакцияповторена три раза, анализ продублирован на независимо выделенных органах.8Вестерн-блот анализ с антителами к фрагменту экзона 9 белка SBR описан встатье Ginanova et al. 2016.Дизайн пептидов, получение и очистка поликлональных кроличьих антител напоследовательности экзона 1 белка SBR. Для получения антител к N-концу белка SBRбыли выбраны и синтезированы 2 пептида длиной 15 ак.
Антигенность, гидрофильностьи вторичные структуры пептидов предсказаны с помощью Antibody Epitope Prediction,IEDB Analysis Resource5. Уникальность пептидов для белков дрозофилы и кроликапроанализирована С. Ф. Кливером. Пептиды конъюгированы с катионизированным БСА(бычьим сывороточным альбумином). Схема внутрикожной иммунизации кроликов:первая иммунизация – 300 мкл раствора конъюгата пептид-БСА (200 мг пептида) в PBS1:1 с полным адъювантом Фрейнда (Sigma, США); последующие иммунизации – через 2недели, 1:1 с неполным адъювантом Фрейнда (Sigma, США). На 12 день после 3ейиммунизации – забор крови и получение сыворотки.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
