Автореферат (1145735), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Аффинность сывороток былапроверена в ИФА (иммуноферментном анализе), IgG фракцию выделяли на белке А,специфичность антител проверяли в вестерн-блот анализе на тотальном растворимомбелке, выделенном из взрослых особей дрозофилы. Дальнейший анализ проводилитолько с антителами, выработанными на пептид №1 (42-56 ак белка SBR –DRNKRRVSFKPSQCL).Получение рекомбинантных белков SBR в E. coli. Векторы pET-22b(+) (Novagen,США) для экспрессии белков SBR в бактериях (штамм BL21 Star™ (DE3), Invitrogen,США) несли следующие вставки: recSBR – 505-2523 н. мРНК sbr (NM_079921.3) иrecSBR-ir – 505-1485 н. мРНК sbr + 10572-10589 н. гена sbr (NC_004354.4).Вестерн-блот анализ с антителами к фрагменту белка SBR, соответствующемучасти экзона 1. Из имаго D. melanogaster дикого типа были выделены игомогенизированы яичники, семенники, головы, затем определена концентрация белка вобразцах (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo Scientific, США).
Вэлектрофоретический анализ в 12% ПААГ брали по 5 мкг белка на лунку, перенос намембрану контролировали окраской Ponceau S. Первичные поликлональные кроличьиантитела, полученные нами, использовали в концентрации 5 мкг/мл, вторичные антикроличьи антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) – 1:3000.Детекция: DAB Substrate Tablets (Amresco, США).Глава 3Результаты3.1 Анализ транскриптов гена sbr в тканях семенников, голов и яичниковвзрослых особей D.
melanogaster линии дикого типа Oregon-RОргано-специфичные продукты гена sbr могут выполнять специализированныефункции, поэтому необходимо было охарактеризовать максимально широкий спектртранскриптов и белков, кодируемых этим геном. В данной работе мы применилиразличные техники ПЦР, чтобы определить, какие последовательности гена попадают втранскрипты, характерные для различных органов D.
melanogaster, и оценитьколичественное соотношение альтернативных транскриптов. Важно было определитьтакже спектр альтернативных белков, кодируемых этими транскриптами.Основной метод, позволяющий определить 3′- и 5′-концы транскриптов – этоRACE-PCR (быстрая амплификация концевых последовательностей кДНК). Суть методазаключается в том, что на этапе получения кДНК оба конца транскрипта определённымобразом метятся, что при дальнейшем секвенировании продуктов ПЦР даёт однозначнуюинформацию о концевых последовательностях транскриптов.
Проанализированы былиобразцы, полученные из тканей голов, семенников и яичников, поскольку именно эти5http://tools.immuneepitope.org/bcell9ткани, по полученным ранее данным (Ivankovaetal.2010),отличалисьприсутствием альтернативных транскриптов.Нами показано, что большинство транскриптов гена sbr в семенниках укороченыс 3′-конца (Рис. 3) (Ginanova et al. 2016). По результатам секвенирования длина 3′UTRтранскриптов варьирует и составляет от 44 до 124 н. (3′UTR универсального,представленного в базе данных, транскрипта насчитывает 757 н.), поэтому в семенникахдаже транскрипты, включающие все экзоны, оказываются короче (2.8 т.н.), чемтранскрипты в других органах (3.5 т.н.).Рисунок 3. Результаты 3′ RACE-PCR на основе образцов РНК из различных органов,полученные с использованием одного и того же прямого праймера в экзоне 9 (ex9F) генаsbr.
А – Схема расположения праймеров на гене sbr в последовательных раундах RACEPCR; I раунд – ex4F, II раунд – ex9F; Б – Электрофореграмма II раунда ПЦР: основнойпродукт амплификации в семенниках (отмечен стрелкой) значительно короче, чем вобразцах из голов или яичников D. melanogaster (Ginanova et al. 2016).Что касается короткого семенниково-специфичного транскрипта 1.9 т.н., врезультате 5′ RACE-PCR было установлено, что он начинается в самом длинноминтроне 3 гена sbr (Ginanova et al. 2016).
По нашим результатам транскрипт 1.9 т.н.представлен двумя основными типами (Рис. 4): транскрипты первого типа начинаются винтроне 3 с 9628 н. гена (нумерация приведена по записи гена sbr в GenBank, ID 43944) идалее не отличаются от полностью сплайсированного транскрипта гена sbr; транскриптывторого типа начинаются в интроне 3 чуть раньше (с 9580 – 9621 н.) и обязательноподвергаются альтернативному сплайсингу с вырезанием 237 н. 3′-конца интрона 3.Полученные результаты были независимо подтверждены ПЦР с обратной транскрипциейи согласуются с результатами анализа данных эксперимента CAGE-seq (анализ проведёнС.Ф.
Кливером).В образцах РНК, выделенных из тканей головы взрослых дрозофил, порезультатам 5′ RACE-PCR нам удалось идентифицировать TSS (точки стартатранскрипции) в трёх областях: в экзоне 1 (2, 13 и 22 н., а также впервые выявленныеTSS 206-236 н.) и в экзоне 4 (282 н. экзона 4). Транскрипты, берущие начало в экзоне 1,могут кодировать полноразмерный белок Dm NXF1, поскольку старт-кодон трансляциинаходится позже – в позиции 505 н. Кодирует ли белок транскрипт, начинающийся вэкзоне 4, неизвестно. В ходе анализа 3′-концов мРНК гена sbr в образцах из головD.
melanogaster были впервые выявлены альтернативные сайты полиаденилирования(PAS). Мажорные транскрипты являются полноразмерными, минорные транскриптызаканчиваются в районе 471 н. 3′UTR (за 286 н. до конца 3′UTR).10Рисунок 4. Результаты 5′ RACE-PCR с образцами кДНК, полученными на основе РНК изорганов самцов D. melanogaster дикого типа, с одним и тем же обратным праймером награнице экзонов 6-7 (ex6-7R) гена sbr. А – Схема расположения праймеров на гене sbr впоследовательных раундах RACE-PCR; Б – Электрофореграмма III раунда ПЦР: помимополноразмерного транскрипта, такого же, как в тканях головы, в семенниках существуеттакже более короткий продукт амплификации (показан стрелкой), что являетсяотражением использования в тканях семенника альтернативного промотора при синтезесоответствующего транскрипта.
Видно, что коротких фрагментов два – это два разныхтипа транскриптов, начинающихся в интроне 3 гена sbr (Ginanova et al. 2016).Среди проанализированных тканей наибольшее разнообразие транскриптов sbrнам удалось выявить в пробах из яичников взрослых самок. Мажорная фракциятранскриптов начинается не в районе, соответствующем 5′UTR гена sbr, как этохарактерно для остальных проанализированных органов, а позже – в середине экзона 2(73 н.
экзона 2), в середине экзона 3 (51 н. экзона 3), в начале экзона 4 (22 и 40 н.экзона 4). Новых PAS в транскриптах гена sbr в тканях яичников по сравнению странскриптами из тканей головы тех же особей выявлено не было.Поскольку ранее было показано, что нейроспецифичный транскрипт 5.1 т.н.образуется путём сохранения интрона 5 длиной 1602 н. (Ivankova et al.
2010), отдельнобыли проанализированы мРНК, сохраняющие указанный интрон. Интрон-содержащиетранскрипты начинаются там же, где и полностью сплайсированные – с 23 н. и 231 н. отначала гена sbr. Анализ 3′-концов интрон-содержащих транскриптов привёл кнеожиданным результатам: мажорная фракция выявляемых транскриптов заканчиваласьв интроне 5. Поскольку в интроне 5 гена sbr находятся протяжённые последовательностиполи(А), на которые может отжигаться праймер олиго(dT), используемый на этапеполучения кДНК, встал вопрос о том, не являются ли 3′-концы транскриптов,выявляемые в интроне 5, артефактом метода.3.2Количественная характеристика транскриптов гена sbrЧтобы количественно определить содержание транскриптов, различающихсявключением различных участков гена sbr, мы использовали метод ПЦР в реальномвремени.11Рисунок 5.
Соотношение присутствия двух участков в транскриптах sbr в образцах изразных органах дрозофил дикого типа (“ex4-5” включает части экзонов 4 и 5, “ex9” –часть экзона 9). А – схема расположения праймеров на гене sbr; Б –анализ результатовПЦР в реальном времени; погрешности вычислены на основе SEM (стандартной ошибкисреднего) для среднего Ct (порогового цикла).На первый взгляд, данные о том, что транскриптов с участком ex4-5 всегдабольше, чем транскриптов с участком ex9 (рис.
5), согласуются с гипотезой, что частьтранскриптов заканчивается в интроне 5 и поэтому не содержит участка ex9. Однакоаналогичную картину мы видим и в образцах из тканей семенников, для которых интронсодержащие транскрипты в экспериментах RACE-PCR и ПЦР-РВ мы всегда выявляли вследовых количествах.
Таким образом, мы не смогли ответить на вопрос, оканчиваютсяли транскрипты гена sbr дрозофилы в интроне 5, поэтому решили оценить такуювозможность для ортологичного гена Mm nxf1 мыши.3.3 Существуют ли транскрипты, оканчивающиеся в интроне 10, в различныхтканях M. musculus?В интрон-содержащем транскрипте гена Mm nxf1 сохраняется интрон 10,гомологичный интрону 5 гена sbr дрозофилы. В интроне 10 Mm nxf1 отсутствуютпротяжённые последовательности поли(А) (Mamon et al. 2013), по-видимому,препятствующие прохождению ПЦР.
Кроме того, в интроне 10 позвоночных мыобнаружили два минорных сайта полиаденилирования AAGAAA. Эти сайты и ихокружение в интроне 10 гена Nxf1 позвоночных оказались эволюционноконсервативными(анализпроведёнС. Ф. Кливером).Дляпроверкиихфункциональности мы выбрали несколько тканей мыши для исследования (ткань мозга,мышечная ткань бедра, семенник). По результатам 3′ RACE-PCR можно утверждать, чтов тканях семенника содержание транскриптов с интроном исчезающее мало, а в нервнойи мышечной тканях большинство транскриптов гена Nxf1 (как содержащие, так и несодержащие интрон 10) заканчиваются в 3′UTR. Лишь в образцах РНК из мышцсуществует небольшое количество транскриптов, при образовании которых используетсяодин из консервативных минорных сайтов полиаденилирования в интроне 10.123.4 Разнообразие транскриптов гена sbr в тканях головы, семенников ияичников D.
melanogasterНа рисунке 6 наиболее полно представлены все вероятные транскрипты гена sbr висследуемых органах.Рисунок 6. Состав всех вероятных транскриптов гена sbr в разных органах.Последовательности транскриптов определены с помощью метода RACE-PCR. Длякаждого органа под наименьшим номером изображён самый распространённыйтранскрипт. Справа вычислена длина транскрипта в тысячах нуклеотидов.
Звёздочкамиотмечены уникальные транскрипты, не выявленные в других органах. Серые блоки13обозначают нетранслируемые области (5′UTRштриховкой выделен сохранённый интрон 5.и3′UTR),чёрные–экзоны,3.5 Идентификация белков SBR, кодируемых специфичными для семенниковтранскриптами и транскриптами с сохранённым интроном 5Все представленные на рисунке 6 транскрипты способны кодировать белок. 19потенциально возможных транскриптов гена sbr способны дать начало 7 различнымбелкам. Чтобы ответить на вопрос, существуют ли такие белки на самом деле, первымшагом является проведение вестерн-блот анализа с белковыми пробами, выделенными изразных органов дрозофилы: семенников, голов и яичников.Готовых коммерческих антител к белку дрозофилы SBR не существует, поэтомудля идентификации белков необходимо было получить антитела. Поскольку в тканяхсеменников количество транскриптов невелико, все они являются специфичными дляэтого органа, один из них кодирует универсальный белок SBR, а остальные, по нашемупредположению, – укороченный на 136 ак с N-конца белок, мы начали с анализа белковсеменников.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
