Автореферат (1145735), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Мы использовали полученные Н. Иванковой антитела к С-терминальномуфрагменту белка SBR в вестерн-блот анализе, чтобы определить, являются лисеменниково-специфичные транскрипты, синтез которых начинается на промоторе винтроне 3, белок-кодирующими.В результате проведённого анализа известная универсальная изоформа белка SBRмолекулярной массы 74 кДа (расчётная масса 76 кДа) обнаружена во всех исследованныхтканях D.melanogaster (Рис. 7). Помимо этого, среди белков, выделенных из семенников,наряду с универсальным белком присутствует более короткая форма – около 60 кДа(Рис. 7, дорожки 4, 5). По молекулярной массе она соответствует белку, кодируемомутеми транскриптами, которые в семенниках синтезируются с альтернативного промоторав интроне 3 (расчётная масса 60 кДа).
Такой белок мы называем SBR-t от «testes» –семенники. Более того, у мутантных самцов sbr12/Dp(1;Y) y+ v+, гетерозиготных поделеции sbr12 и аллелю sbr+, белок SBR представлен двумя фракциями – нормальными(SBR, SBR-t) и укороченными в результате делеции (SBR12, SBR12-t) (Рис. 7, дорожка 4).Аллель sbr12 – делеция 30 н. и, соответственно, 10 ак. У гетерозиготных самцов sbr12/sbr+антитела выявляют как нормальные белки, так и белки с делецией, что подтверждаетспецифичность антител в отношении белка SBR. Антитела к С-концу белка SBRпозволили выявить новую специфичную для семенников изоформу SBR-t массой 60 кДа(Ginanova et al. 2016).Рисунок 7. Вестерн-блот анализбелков, выделенных из органовимаго D.
melanogaster, несущихразличные аллели гена sbr. Стрелкауказывает на универсальный белокSBR, треугольник – на короткийсеменниково-специфичный белокSBR-t.Двойнаяполосканаблюдаетсявобразцеизсеменниковсамцов-носителейаллеля sbr12. Дорожки: 1 – яичникисамок дикого типа; 2 – головы самцов sbr12 / Dp(1;Y) y+ v+; 3 – головы самцовFM6v, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+ (без делеции sbr12); 4 – семенники самцовsbr12 / Dp(1;Y) y+ v+; 5 – семенники самцов FM6v, y sc8 dm B / Dp(1;Y) y+ v+ (Касаткина,2007; Ginanova et al. 2016).14Посколькусохранение гомологичногоинтронаэволюционноконсервативно для генов Nxf1 (Мамон и др. 2013), особый интерес представляют самыедлинные транскрипты гена sbr, сохраняющие интрон 5.
В начале этого интронаприсутствует стоп-кодон, что позволяет транслировать с последовательности интроналишь 5 аминокислот. Короткий белок NXF1, транслируемый с интрон-содержащеготранскрипта, был идентифицирован группой под руководством M.-L. Hammarskjold вкультуре клеток человека HEK293T (Li et al. 2006) и тканях мыши (Кливер, 2016; Li et al.2016). Было необходимо установить, присутствует ли в тканях дрозофилы аналогичныйкороткий белок. Мы подобрали и синтезировали уникальный олигопептид на N-концебелка SBR, который использовали для иммунизации кролика. Для доказательстваспецифичности антител мы экспрессировали рекомбинантные белки recSBR(полноразмерный) и recSBR-ir (соответствующий транскрипту с интроном) в E.
coli.Расчётные молекулярные массы таких белков – 76 и 38 кДа, соответственно. Привестерн-блот анализе мы видим связывание антител с белками похожей молекулярноймассы (Рис. 8). Кроме того, эксперименты с отменой связывания также указывают наспецифичность антител к нативному белку дрозофилы.Рисунок 8. Результаты проверки антител с использованием рекомбинантных белковдрозофилы, синтезированных в E. coli. А – демонстрация индукции синтезарекомбинантных белков в E. coli, ПААГ-электрофореграмма, окраска Coomassie; Б –демонстрация равной нагрузки образцов после переноса на нитроцеллюлознуюмембрану, окраска Ponceau S; В – демонстрация связывания антител с белками recSBR иrecSBR-ir.
Дорожки: 1 – лизат бактериальной культуры-продуцента recSBR до индукцииплазмидного промотора; 2 – то же, что и 1, после индукции; 3 – лизат бактериальнойкультуры-продуцента recSBR-ir до индукции; 4 – то же, что и 3, после индукции.Для вестерн-блот анализа с полученными антителами были взяты растворимыефракции белков дрозофилы, выделенные из разных органов взрослых особей дикоготипа: из голов, из яичников, из семенников. Короткий белок с расчётной молекулярноймассой около 42 кДа нам удалось выявить в образцах из яичников и голов самок (Рис. 9).Этот белок SBR, кодируемый интрон-содержащим транскриптом, мы называем SBR-ir от«intron retention» – сохранение интрона.15Рисунок 9.
Результаты вестерн-блотанализа белков, выделенных из разныхоргановвзрослыхособейD. melanogasterлинииOregon-R.Дорожки: яич. – яичники, сем. –семенники, гол. – головы. Стрелкауказывает на короткий белок SBR-ir,кодируемыйтранскриптомссохранённым интроном 5.3.6Выявленные экспериментально белки SBRБелки, которые мы детектировали двумя типами антител (к N- и C-концу SBR),схематично изображены на рисунке 10.Рисунок 10.
Экспериментально обнаруженные белки SBR D. melanogaster. SBR –полноразмерный белок; SBR-t – укороченный с N-конца белок, специфичный длясеменников; SBR-ir – укороченный с C-конца белок, кодируемый интрон-содержащимтранскриптом и выявляемый в тканях головы и яичника; SBR12 – полноразмерный белокс делецией 10 ак, продукт аллеля sbr12; SBR12-t – укороченный с N-конца семенниковоспецифичный белок с делецией 10 ак, продукт аллеля sbr12.Нам не удалось выявить белки, соответствующие транскриптам с TSS в экзонах 2,3 и 4 в яичниках и белок, соответствующий транскриптам с TSS в экзоне 4, в образцах изголов дрозофил. По-видимому, такие белковые формы либо не существуют, либо менеепредставлены, по сравнению с полноразмерным белком.16Глава 4 ОбсуждениеВ эволюции усложнение организации особей шло не столько по пути увеличениячисла генов, сколько по пути повышения многообразия их продуктов.
Это позволилоодному и тому же гену производить продукты как с универсальной, так и соспециализированными функциями. Гены Nxf1 эволюционно древние: гомолог Nxf1дрожжей, MEX67, появляется в эволюции одновременно с образованием ядерноймембраны и обеспечивает экспорт мРНК из ядра в цитоплазму (Segref et al.
1997). Белкисемейства NXF объединяет сходство их доменной структуры с белком NXF1 человека(Herold et al. 2000). Формирование генного семейства Nxf происходило в результатеразличных механизмов, таких как дупликация гена за счёт хромосомных перестроек илинеравного кроссинговера с последующей дивергенцией его копий. Специализированныефункции генов семейства Nxf не всегда известны.У D.melanogaster ген sbr (Dm nxf1) является наиболее изученным – функции геновпаралогов из семейства Nxf дрозофилы остаются неизвестными. В данной работе былиописаны транскрипты гена sbr, которые характерны для тканей семенников или головывзрослых особей дрозофилы; есть и такие, которые встречаются только в яичниках.Помимо характеристики транскриптов в работе была проверена гипотеза оспециализации нейроспецифичных и семенниково-специфичных транскриптов sbr,которая привела к идентификации двух укороченных изоформ белка SBR: SBR-t иSBR-ir.Все три белка SBR (универсальный SBR и тканеспецифичные SBR-t и SBR-ir)сохраняют домен RBD, что позволяет предполагать у них способность связываться сРНК.
Структурные отличия касаются остальных белковых доменов: судя попоследовательности транскриптов, в укороченном с N-конца семенниково-специфичномбелке SBR-t отсутствуют сигнал ядерной локализации, часть домена LRR ипредполагаемый домен олигомеризации, а в белке SBR-ir, который транслируется ссохраняющего интрон транскрипта, отсутствуют С-терминальные домены NTF2-like иUBA. Известной функцией белка SBR является экспорт любых мРНК из ядра, дляосуществления этой функции в белке должны присутствовать все канонические доменысемейства NXF: RBD, LRR, NTF2-like и UBA. Доменная организация укороченныхбелков SBR-t и SBR-ir, а также показанная ранее цитоплазматическая локализация,присущая белкам SBR дрозофилы в разных тканях (Ацапкина и др.
2010; Голубкова и др.2015; Yakimova et al. 2016) и нехарактерная для белков NXF1 млекопитающих,позволяют высказать гипотезу о том, что альтернативные функции белков SBRзаключаются в сохранении связи с РНП комплексами после их экспорта из ядра, аструктурные особенности каждого из белков могут проявляться в специализации белковпо отношению к мРНК-мишеням.Косвенным свидетельством существования определённых мРНК-мишеней, скоторыми связываются белки SBR, являются фенотипические проявления различныхмутаций в гене sbr. Нарушения затрагивают гаметогенез (как у самцов, так и у самок),эмбриогенез и нейрогенез (Golubkova et al.
2009; Никитина и др. 2003; Голубкова и др.2015; Yakimova et al. 2016). Характерная особенность всех этих процессов – запасаниеотдельных мРНК и их хранение во временно нетранслируемом состоянии. ЛокализациямРНК – распространённый и консервативный механизм, обеспечивающий синтез белковименно в том месте, где в этих белках есть потребность (St Johnston 2005), например, всинапсах нейронов. Локализованные мРНК необходимы также в сперматогенезе, где назаключительных стадиях происходит блок транскрипции, и в ходе эмбриогенеза, прикотором в первых делениях дробления транскрипция также не происходит. Таким17образом, белки SBR, являясь РНК- связывающимибелками,способнывзаимодействовать с различными, специализированными для различных клеточныхпроцессов, мРНК и участвовать в регуляции своевременной и локализованнойтрансляции таких мРНК.
Стоит отметить, что паралоги гена Nxf1 млекопитающих (но неген Nxf1) экспрессируются преимущественно в тканях мозга, или мозга и семенников, атакже в период эмбриогенеза, т.е. как раз там, где существенную роль в экспрессии геновиграет пост-транскрипционная регуляция. Преимущественная цитоплазматическаялокализация белков, кодируемых генами-паралогами Nxf1 млекопитающих, далаоснование предполагать, что специализация этих генов в пределах семейства шла попути ограничения круга мРНК теми, которые относятся к классу долгоживущих иорганоспецифичных (Jun et al. 2001; Sasaki et al. 2005; Tan et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
