Диссертация (1145736), страница 3
Текст из файла (страница 3)
coli.Положения, выносимые на защитуВ основе специализации функций гена sbr D. melanogaster, по-видимому, лежатмолекулярные процессы, приводящие к возникновению множества транскриптов и белковыхпродуктов этого гена. В тканях головы, семенников и яичников с гена sbr представленыальтернативные транскрипты, причём некоторые из них встречаются только в семенниках, илив тканях головы, или в яичниках. Эволюционно консервативные транскрипты гена sbr (Dm nxf1)с сохранённым интроном в тканях головы дрозофилы составляют значительную часть всехтранскриптов гена (до 40%), а в семенниках D. melanogaster, и мыши M.
musculus интронсодержащий транскрипт составляет минорную фракцию. В яичниках и тканях головыD. melanogasterидентифицированановаяизоформаSBR-ir(1-327+5 ак),котораятранслируется с транскрипта с сохранённым интроном. В SBR-ir отсутствуют домены,необходимые для связи с кофактором Nxt1 и нуклеопоринами. В семенниках D. melanogasterтакже обнаружена новая изоформа SBR-t (137-672 ак), которая синтезируется с транскриптов,начинающихся в интроне 3. В коротком семенниково-специфичном белке SBR-t по сравнениюс SBR отсутствует N-терминальная часть белка с сигналом ядерной локализации, чтопредполагает его функцию в цитоплазме. Поскольку все три изоформы белка SBR сохраняютРНК-связывающие домены, специализированные функции гена sbr, по-видимому, заключаютсяв том, что белок SBR или его органоспецифичные формы участвуют в метаболизме и/илисохраняют связь в цитоплазме с какими-то особыми мРНК, входя в состав мРНП комплексов иобеспечивая регуляцию экспрессии разных генов на пост-транскрипционном уровне.Степень достоверности и апробация результатовПо материалам работы опубликованы следующие статьи:101.
Ginanova V., Golubkova E., Kliver S., Bychkova E., Markoska K., Ivankova N., Tretyakova I.,Evgen’ev M., Mamon L. 2016. Testis-specific products of the Drosophila melanogaster sbrgene, encoding nuclear export factor 1, are necessary for male fertility. Gene 577 (2): 153-160.2. Mamon L.A., Kliver S.F., Prosovskaya A.O., Ginanova V.R., Golubkova Ye.V. 2014. Theintron-containing transcript: an evolutionarily conserved characteristic of the genes orthologousto nxf1 (nuclear export factor 1). Russian Journal of Genetics: Applied Research, Vol. 4, No.
5,pp. 434–443 (версия на русском языке – Мамон Л.А., Кливер С.Ф., Просовская А.О.,Гинанова В.Р., Голубкова Е.В. 2013. Интрон-содержащий транскрипт - эволюционноконсервативная особенность генов-ортологов nxf1 (nuclear export factor). Экологическаягенетика №11(3), с. 3-13.3. Golubkova E., Mamon L., Nikulina A., Merezhko M., Ginanova V. and Evgen’ev M. 2012.The Evolutionarily Conserved Family of Nuclear Export Factor (NXF) in DrosophilaMelanogaster. Drosophila Melanogaster: Life Cycle, Genetics. Nova Biomedical Books, NewYork, p. 63-82.Изложенные в работе данные были представлены в виде устных докладов наV молодёжной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологииРАН (Санкт-Петербург, Россия, 18-21 сентября 2016 г.), на 19-й Международной Пущинскойшколе-конференции молодых ученых «БИОЛОГИЯ – НАУКА ХХI ВЕКА» (Пущино, Россия,20 – 24 апреля 2015 г.), на 4th German-Russian Young Researchers’ Forum (Санкт-Петербург,Россия, 6 – 10 июля 2014 г.), на VI Съезде ВОГиС (Ростов-на-Дону, Россия, 15 – 20 июня 2014г.) и постерных докладов на The 6th EMBO Meeting (Birmingham, UK, 5 – 8 сентября 2015 г.), наEMBO | EMBL Symposia: The Complex Life of mRNA (Heidelberg, Germany, 5 – 8 октября 2014г.), на The FEBS-EMBO 2014 Conference (Paris, France, 30 августа – 4 сентября 2014 г.), наEMBO Drosophila Cell Division Cycle Workshop (Dartington Hall, Devon.
UK, 12 – 16 сентября2013 г.), на Cold Spring Harbor Asia Conference «RNA Biology» (Suzhou, China, 8 – 12 октября2012 г.).Материалы диссертации легли в основу конкурсных проектов, один из которых победилна конкурсе грантов Санкт-Петербурга для студентов, аспирантов, молодых учёных, молодыхкандидатов наук 2012 г., а второй прошёл в финал конкурса «Молодые, дерзкие,перспективные» в номинации «Научно-исследовательский проект» в 2015 г.Все результаты экспериментов были подтверждены независимыми биологическими иинструментальными повторениями.11Глава 1 Обзор литературы1.1Ядерно-цитоплазматический экспорт мРНК: история вопросаНуклеиновые кислоты были открыты в 1868 году молодым швейцарцем ФридрихомМишером (Friedrich Miescher).
Исследуя белки лейкоцитов, он обнаружил вещество снехарактерными для белка свойствами. Мишер получил первый очищенный препарат ДНК иизучил состав и свойства этого вещества. Из-за того, что это вещество было обнаружено вядрах клеток, Мишер назвал его «нуклеин». Этот термин используется в названии ДНК и РНКпо сей день (по Dahm, 2005).В начале 1900ых уже было понятно, что речь идёт о двух различных соединениях. Ихназывали «нуклеиновая кислота животных» (в будущем – ДНК) и «нуклеиновая кислотарастений» (ранее – дрожжей, в будущем – РНК), имея в виду, что в ядрах клеток животных ирастений всегда можно обнаружить тот или иной нуклеин.
Впоследствии, когда сталовозможным разделить ядро и цитоплазму клеток, стало понятно, что эти вещества находятся вразных частях клеток (показано на эмбрионах ржи): нуклеиновая кислота животных есть влюбых ядрах, независимо от их природы, а нуклеиновая кислота растений более характерна дляцитоплазмы. Более того, в составе этих нуклеиновых кислот присутствуют разные сахара – dрибоза и d-2-дезоксирибоза (по Allen, 1941).Предположение о том, что роль РНК связана с белковым синтезом, было выдвинуто в1939 году T.
Caspersson и основано на том, что в растущих тканях содержание нуклеиновыхкислот в цитоплазме значительно выше, чем в зрелых (Caspersson et al. 1939). Подтвердил этопредположение бельгийский биолог Джин Брэчет (Jean Brachet). Работая на Acetabularia,зелёной одноклеточной водоросли, Брэчет показал, что в энуклеированных клетках(искусственно лишённых ядра), которые содержали много базофильно окрашивающегосяматериала (РНК), встраивание меченых аминокислот (т.е. синтез белка) продолжалось втечение нескольких дней (по Darnel, 2013).После того, как Джеймс Уотсон (James Watson) и Фрэнсис Крик (Francis Crick) в 1953году опубликовали структуру молекулы ДНК и Центральную догму молекулярной биологии(на основе ДНК образуется РНК, а на основе РНК – белки), научное сообщество переключилосьна исследование РНК как следующего кусочка паззла на пути к пониманию молекулярнойосновы жизни.
РНК стала единственной в истории молекулой, вдохновившей учёных насоздание клуба – “RNA Tie Club” (Клуб Галстуков с РНК), основанного в 1954 году (Рис. 1).Членами этого клуба были Джеймс Уотсон и Френсис Крик (Нобелевская премия 1962 года заоткрытие структуры ДНК), Сидней Бреннер (Sydney Brenner) (предложил концепцию кодонов,12исследовал регуляцию генов на C.elegans, Нобелевская премия 2002 года), Эрвин Чаргафф(Erwin Chargaff) (определил, что количество аденинов в молекуле ДНК такое же, как тиминов, агуанинов – такое же, как цитозинов), Георгий Гамов (физик-теоретик, занимавшийсягенетическим кодом), Макс Дельбрюк (Max Delbrück) (Нобелевская премия 1969 года заоткрытия, касающиеся механизма репликации и генетической структуры вирусов) – всего 20регулярных членов (по числу аминокислот) и 4 почётных члена (по числу нуклеотидов), 8 изкоторых имели Нобелевскую премию или получили её в будущем.
Каждый из членов клубаимел чёрный шерстяной галстук с изображением жёлто-зелёной спирали (идея и дизайнГ. Гамова) и золотую булавку для галстука с гравировкой имени (индивидуальнаяаминокислота для каждого члена клуба в трёхбуквенном обозначении). Основной задачей клубабыло узнать, как РНК участвует в синтезе белка. Их девиз был «do it or die, or do not try» сделай это или умри, или не пытайся (по Clancy, 2014; The Pauling Blog website4, 2016).Рисунок 1.
"RNA Tie Club," Портагл-плэйс, Кембридж, Великобритания, 1955 год. Слеванаправо: Francis Crick, Alexander Rich, Leslie E. Orgel, James Watson. (Права на изображениеAlexander Rich. Linus Pauling and the Race for DNA website).Итак, в середине 1950ых взаимосвязь ДНК, РНК и белка по-прежнему оставаласьзагадочной. РНК выявлялась и в цитоплазме, и в ядре, но было неясно, где и из чего онасинтезируется.
Для того чтобы наблюдать синтез РНК в живой клетке, учёные разработали4https://paulingblog.wordpress.com/2009/09/01/dna-the-aftermath13технику авторадиографии. РНК метили радиоактивными рибонуклеотидами (3H, 14C и 32PO4) идля визуализации выдерживали меченые образцы в формальдегиде, а затем экспонировалиплёнку. Используя этот метод, учёные показали, что радиоактивность сначала появляется вядре клетки и лишь затем в цитоплазме. Многие полагали, что это говорит о том, что РНКсинтезируется в ядре, а затем экспортируется в цитоплазму. Другие же считали, что синтезможет происходить и внутри, и за пределами ядра, но в ядре этот процесс быстрее.Лестер Голдштейн и Уолтер Плот (Lester Goldstein, Walter Plaut) придумали изящныйэксперимент, чтобы изучить взаимоотношения между ядерной и цитоплазматической РНК.
Онирадиоактивно пометили РНК в амёбах (Amoeba proteus), а затем трансплантировалииндивидуальные меченые ядра в немеченных предварительно энуклеированных амёб.Голдштейн и Плот фиксировали образцы в разное время и анализировали автографы, такимобразом, им удалось проследить путь меченой РНК (Рис. 2). На ранних отрезках времени всярадиографическая метка была сосредоточена в ядре, а затем начинала выявляться и вцитоплазме. Так было показано, что существует транспорт РНК из ядра в цитоплазму (поRalston & Shaw, 2008).Рисунок 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
