Диссертация (1145736), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Определение природы РНК: ядерная или цитоплазматическая? 1А – изображениеамёбы через 6 минут после трансплантации меченого ядра (отмечено стрелкой), фазовыйконтраст. 1В – авторадиографическое изображение амёбы, показанной на 1А. Радиоактивнаяметка выглядит, как чёрное пятно, и сосредоточена в ядре (стрелка). 2А – изображение амёбычерез 62 часа после трансплантации меченого ядра (отмечено стрелкой), фазовый контраст.
2В– авторадиографическое изображение амёбы, показанной на 2А. Радиоактивная метка всё ещёвыявляется в ядре (стрелка), но также в виде серого ореола распространяется вокруг ядра (на 1Вподобного не наблюдается) (Goldstein & Plaut, 1955).14Понимание того, что существуют различные типы РНК, пришло в начале 1960ых. Убактерий оказались две основные фракции: стабильные мажорные рибосомные РНК ~1.5 и~3.0 т.н. и нестабильная минорная фракция 1-2 т.н. Позднее выяснилось, что эта фракцияпредставляет собой мРНК. Первые эксперименты по анализу седиментации у эукариот (1962год) выявили ядерную РНК, длина которой была больше, чем пре-рибосомной РНК, о которойзнали уже достаточно много (некоторые были более 40 т.н., тогда как 45S пре-рРНК имеетдлину 14 т.н.).
Через год мРНК длиной 1-3 т.н. была обнаружена на полирибосомах. Её назвалиДНК-подобной РНК из-за низкого содержания G+C нуклеотидов (в отличие от рРНК) ипредположили, что предшественником такой РНК является ядерная РНК с похожим G+Cсоставом. Так родилась идея о процессинге мРНК.В 1970ые годы доказали наличие на 3’-конце мРНК как в ядре, так и полирибосомахполиаденина, а на 5’-конце – метилгуанидинового кэпа. Также при помощи электронноймикроскопии на примере аденовирусной мРНК было показано, что первичные длинныемеченые транскрипты преобразуются затем в более короткие, т.е.
обнаружен сплайсинг.Подтверждение этому опубликовал Конкл (D.A. Konkel) в декабре 1978 г., приведя в качестведоказательства последовательность гена β-глобина мыши. К началу 1990ых стал приблизительнопонятен механизм сплайсинга. Параллельно накапливались знания о механизмах транскрипции.Например, РНК-полимераза II была открыта в 1969 г. Родером и Раттером (Roeder, Rutter).Последние 15-20 лет были посвящены изучению связи между синтезом РНК, её процессингом итранспортом через ядерную мембрану (по Darnel, 2013).Ядернаяоболочкапроницаемадлямакромолекул.То,чтоядерно-цитоплазматический транспорт осуществляется через специализированные участки ядернойоболочки кольцевой формы, показали в 1962 г. в лаборатории Карла Фелдхера (Carl Feldherr).Они инъецировали в цитоплазму амёб (Chaos chaos) частички коллоидного золота разногоразмера и заряда и наблюдали за их перемещением в клетке при помощи электронноймикроскопии.
Отрицательно заряженные частицы (покрытые поливинилпирролидоном)транспортировались в ядро в зависимости от размера (более крупным это не удавалось) и, повидимому, это происходило через центральный канал неких кольцевых структур. В ооцитахXenopus транспорт в ядро частиц золота, связанных с кариофильным белком нуклеоплазмином,также осуществлялся через ядерные поры. Нуклеоплазмин же, лишённый домена для ядерногоимпорта, в ядро не попадал. Так были показаны пассивный и активный ядерноцитоплазматический импорт и существование ядерных пор (по Feldherr, 1962; Feldherr et al.1984).15Затем в белках были описаны специализированные сигнальные последовательностидля ядерного импорта (NLS – nuclear localization signal) и экспорта (NES – nuclear export signal),челночные белки, осуществляющие активный белковый экспорт и импорт – кариоферины илитранспортины.
Но как экспортируется из ядра РНК? Первые работы по экспорту РНК былисделаны на белке Rev вируса иммунодефицита человека (HIV-1) (1994-1995 годы). Синтезбелков HIV-1 происходит с альтернативно сплайсированных мРНК, в некоторых из которыхостаются интроны, что должно препятствовать их нормальному экспорту из ядра. Однакоинтрон РНК HIV-1 содержит RRE (Rev response element) – сайт посадки для вирусного белкаRev. В Rev есть NES, следовательно, он экспортируется из ядра, опосредуя, таким образом, иэкспорт связанной с ним вирусной мРНК.
Но как же обстоит дело с обычными клеточнымиРНК? Было показано, что для разных классов РНК (мРНК, тРНК, рРНК, мяшРНК) экспортосуществляется класс-специфичными факторами. В любом случае для экспорта РНК необходимадаптер – РНК-связывающий белок. В случае мРНК экспортируется большой молекулярныйкомплекс – РНК и связанные белки – рибонуклеопротеин (РНП) (по Görlich & Mattaj, 1996).Оставалось найти адаптер для экспорта мРНК. На этот вопрос попытались ответить,исследуя модельный одноклеточный эукариотический организм – дрожжи Saccharomycescerevisiae. При генетическом скрининге температуро-чувствительных мутантов дрожжей(1995 г.) отбирали мутантов с накоплением поли(А)-РНК в ядре. У многих из них былблокирован ядерный экспорт мРНК.
Среди таких генов были выявлены, например, гены,кодирующие белки ядерного порового комплекса, гомолог RCC1 (regulator of chromosomecondensation, он же RanGEF – Ran guanine nucleotide exchange factor). Таким же образом былидентифицирован фактор Mex67p (ген MEX67 - messenger RNA export factor of 67 kDa molecularweight), оказавшийся при более детальном исследовании основным неспецифическим факторомядерного экспорта всех клеточных мРНК (по Segref et al.
1997).Для гомолога Mex67p человека – TAP (Tip-associated protein) в это же время былапоказана функция экспорта ретровирусных интрон-содержащих мРНК (похожая роль с белкомRev HIV-1). Однако в этом случае вирус MPMV (Mason Pfizer Monkey virus) использует несобственный белок, а белок клетки-хозяина. Последовательность в интроне вирусной мРНК,необходимая для экспорта, называется CTE (constitutive transport element) (Grüter et al. 1998).Затем на ооцитах Xenopus показали, что при избытке CTE-содержащей РНК и недостатке TAP вядре накапливаются клеточные мРНК, что продемонстрировало роль TAP в экспорте именноклеточных мРНК. В 2000 году были идентифицированы гомологи TAP человека (всего 6 генов,2 из которых являются псевдогенами), нематоды C.
elegans (2 гена), дрозофилы (4 гена). Так16сформировалось понятие о семействе белков NXF (nuclear mRNA export factor), члены которогоэволюционно консервативны и организованы по общему принципу (по Herold et al. 2000).1.2Эволюционно консервативное семейство генов Nxf у разныхэукариотических организмовВ эволюции количество генов в семействе Nxf увеличивалось: у дрожжей S. cerevisiaeодин ген, у нематоды C. elegans – два, у D. melanogaster и M. musculus – по четыре, у H. sapiens– шесть. За исключением генов Hs nxf4 и Hs nxf6, которые являются псевдогенами, остальныеимеют белковые продукты. Филогенетический анализ белков семейства NXF показывает, чтоувеличение числа контролирующих их генов в разных эволюционных ветвях произошлонезависимо (Herold et al.
2000). Главный ген, давший название семейству, – Nxf1 – у разныхорганизмов отвечает за транспорт большинства мРНК из ядра в цитоплазму (Herold et al. 2003).Эта универсальная функция необходима всем клеткам с активной транскрипцией. Не имеязначительного сходства последовательностей, димер TAP-p15 человека проявляет структурноесходство с димером Mex67-Mtr2 дрожжей и способен возвращать жизнеспособность двойномунокауту mex67/mtr2 дрожжей, что показывает эволюционную консервативность механизмаэкспорта мРНК (Katahira et al.
1999).Рассмотрим доменную организацию белка NXF1 на примере белка человека(Hs NXF1, TAP) – первого открытого и лучше всего изученного представителя семейства.1.2.1 Доменная структура Hs NXF1 (TAP) человека, наиболее изученногобелка семейства NXFБелки NXF называют транспортными рецепторами РНК из-за того, что в одноймолекуле объединены рецепторная и транспортная функции: N-терминальная половина белканеобходима для связывания с мРНК и белками-партнёрами, а С-терминальная – с ядернымпоровым комплексом (ЯПК) и кофактором р15 (Nxt1) (Рис. 3).Рисунок 3 Доменная организация белка TAP (Hs NXF1) (по Braun et al.
2001; Matzat et al. 2008;Li et al. 2016). Расшифровка доменов дана в тексте.17N-терминальная часть включает в себя сигнал ядерной локализации – NLS, чтобыбелок мог попадать в ядро (Kang and Cullen, 1999), РНК-связывающий домен (RBD – RNAbinding domain) и домен лейцин-богатых повторов (LRR – leucine-rich repeat). NLS TAPспособен связываться с пятью различными кариоферинами, обеспечивающими импорт белка вядро: Impβ, Imp4, Imp11, Impα и Kapβ2 (Zhang et al. 2011). RBD состоит из двух RRM (RNArecognition motifs) – типичной для многих РНК-связывающих белков структуры. LRR включает4 тандемных повтора (Liker et al. 2000). Хотя для связывания РНК in vitro достаточно толькоRBD, для экспорта мРНК in vivo необходимо также наличие домена LRR. Для связывания сCTE-РНК также необходимы оба домена (Liker et al.
2000; Katahira et al. 1999).С-терминальная часть TAP состоит из двух доменов: NTF2-like (похожий на факторядерного транспорта NTF2 – nuclear transport factor 2) и UBA (ubiquitin associated взаимодействующий с убиквитином). Домен NTF2-like необходим для взаимодействия TAP сбелком p15. Домен назван так из-за его гомологии фактору, который импортирует RanGDP вядро – NTF2 (nuclear transport factor 2). Белок p15 также гомологичен NTF2. Димеризация p15 иTAP происходит аналогично образованию гомодимеров NTF2 (Suyama et al.
2000). МутантыTAP, не формирующие димеры с p15, не способны осуществлять ядерный экспорт мРНК(Fribourg et al. 2001). В 2015 году появилась информация о том, что в дополнение к РНКсвязывающему сайту в доменах RBD и LRR существует второй – на поверхности домена NTF2like при его димеризации с p15. Только одновременные мутации в RBD и NTF2-like доменахнарушают способность димера Tap-p15 связываться с поли(А)-РНК и экспортировать её из ядра(Katahira et al.
2015).UBA домен представлен во многих ферментах, способных присоединять убиквитин кдругим молекулам, но также есть в белках репарации ДНК и протеинкиназах. Через UBA доменTAP взаимодействует с белками ЯПК. Особое значение в этом взаимодействии имеетконсервативная петля из трёх аминокислот 593-595 NWD (Suyama et al. 2000). И в NTF2like/p15, и в UBA доменах есть по одному карману для связывания FG-повторов, которыехарактерны для нуклеопоринов (Fribourg et al. 2001). Для экспорта мРНК необходимо два такихкармана, то есть оба домена: NTF2-like (обязательно с р15) и UBA (Braun et al. 2002).Помимо способности напрямую связываться с нуклеопоринами для транспорта черезядерную оболочку, TAP содержит несколько сигналов ядерного экспорта (NES): один в LRRдомене (Yang et al. 2001), два в домене NTF2-like (Thakurta et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
