Диссертация (1145736), страница 5
Текст из файла (страница 5)
2004) и ещё один в доменеUBA (Kang and Cullen, 1999). Таким образом, TAP может не только импортироваться в ядроразными путями, но и экспортироваться тоже. Например, в случае повреждения одного изС-терминальных доменов, TAP всё равно может перемещаться из ядра в цитоплазму, как это18делает белок человека NXF3 с укороченным UBA-доменом: его экcпорт из ядра осуществляетсяпо CRM1-зависимому механизму (Yang et al. 2001).Для TAP показано, что белок может образовывать мультимерные комплексы.Обнаружены функциональные три- и тетрамеры TAP, а также комплексы TAP с остальнымибелками семейства NXF человека. Авторы статьи (Matzat et al.
2008) полагают, чтоолигомеризация TAP облегчает продвижение через ядерные поры, а взаимодействие белковNXF позволяет им координировать функции друг друга. Также вероятно, что, поскольку заолигомеризацию ответственен тот же N-терминальный участок белка, что и за взаимодействиеTAP с адаптерными белками (Рис. 3), моно- и олигомеры TAP имеют разный репертуар белковпартнёров.Остальные белки семейства NXF организованы аналогично NXF1 и состоят из тех жеэволюционно консервативных доменов (Рис.
4) (Bear et al. 1999; Katahira et al. 1999).Рисунок 4 Доменная организация белков семейства NXF (Izaurralde, 2002). Hs – Homo sapiens;Ce – C. elegans; Dm – D. melanogaster; Sc – S. cerevisiae.Доменная организация белка NXF1 определяет его функцию – ядерный экспортмРНК. Рассмотрим классический путь экспорта мРНК из ядра клетки в цитоплазму с помощьюосновного фактора экспорта мРНК эукариот, белка NXF1.191.2.2 Механизм экспорта мРНК эукариотПространственное разобщение транскрипции и трансляции делает необходимымэкспорт мРНК из ядра для всех клеток эукариот с активной транскрипцией. Экспорт мРНКпроисходит по особому механизму через специальные транспортные рецепторы (в отличие отбелков и некоторых некодирующих РНК: тРНК, рРНК, микроРНК, мяРНК). Эти транспортныерецепторы не родственны кариоферинам, не требуют градиента Ran (Conti and Izaurralde, 2001)и нуждаются в многочисленных дополнительных факторах – адаптерных белках для связи смРНК и рилизинг-факторах для освобождения РНП комплекса после его экспорта в цитоплазму(Rodriguez et al.
2004). Обычно мРНК эукариот синтезируются РНК-полимеразой II в видепредшественника,которыйзатемпретерпеваетразличныемодификации,называемыесозреванием (или процессингом) пре-мРНК. Созревание пре-мРНК включает в себя 5’кэпирование, сплайсинг, удаление 3’-конца и полиаденилирование. Каждый из этих процессовтребует привлечения к транскрипту большого количества белков, поэтому готовая к экспортумРНК представляет собой большую РНП частицу – мРНК в комплексе с белками.Как правило, экспорт мРНК через ЯПК осуществляет гетеродимер с общимназванием NXF1-Nxt1 (у дрожжей это Mex67-Mtr2, у человека TAP-p15). Хотя in vitro NXF1может связывать РНК напрямую, in vivo привлечение NXF1 к готовой к экспорту мРНКосуществляется через белки-адаптеры (по Matzat et al.
2008). Основным адаптером между NXF1и РНП являются белки ALY/REF (Yra1 у дрожжей). Aly/REF и РНК-геликаза UAP56 (Sub2 удрожжей) входят в состав комплекса TREX (transcription-coupled export) – связующего звенамежду сплайсингом и экспортом мРНК (по Köhler and Hurt, 2007). Взаимодействие NXF1 ссубъединицами комплекса TREX, такими как Aly и Thoc5, вызывает переход РНКсвязывающего домена NXF1 в конформацию, открытую для взаимодействия с РНК (Viphakoneet al. 2012).
TREX включает в себя коровый комплекс THO, а также обозначенные выше белкиUAP56, ALY/REF и CIP29 (по Delaleau and Borden, 2015). ALY/REF, UAP56 и NXF1-Nxt1 такжеассоциированы с EJC (exon-junction complex). EJC связывается с мРНК во время сплайсинга иостаётся связанным при экспорте мРНК и далее, в цитоплазме, регулируя стабильность,трансляцию и локализацию мРНК.
TREX привлекается к 5’-концу мРНК, связываясь с CBP80(cap-binding protein). Это объясняет тот факт, что мРНК экспортируются, начиная с 5’-конца (поKöhler and Hurt, 2007). Считается, что от места синтеза и процессинга к ядерной поре РНПчастицу направляет комплекс TREX-2. Механизм перемещения РНП через ЯПК остаётсядискуссионным. Известно, что это очень быстрый процесс: он занимает 180 мс, из которых80 мс происходит стыковка (докинг) РНП с ЯПК, 5-20 мс – перемещение через центральныйканал ЯПК и около 80 мс – высвобождение.
Более того, в различных экспериментах было20показано, что только 25-35% РНП после успешного докинга экспортируются в цитоплазму,остальные же остаются в ядре (Рис. 5) (по Delaleau and Borden, 2015).Рисунок 5. Процессинг и экспорт мРНК и ядра (по Delaleau and Borden, 2015). Представленыразличные стадии процессинга пре-мРНК: присоединение 7-метил-гуанидинового кэпа (1);сплайсинг (2); процессинг 3’-конца транскрипта. Зрелая мРНК готова к экспорту: основнойэкспортёр мРНК NXF1 функционирует в комплексе с p15 (Nxt1) (4). Затем экспортируемаяРНП-частица достигает ядерной поры (5); NXF1 взаимодействует с TPR (translocated promoterregion), чтобы обеспечить докинг (стыковку) РНП с ядерной корзиной порового комплекса (6);взаимодействие с TPR запускает перемещение РНП через канал ЯПК (7); взаимодействие сцитоплазматическими филаментами ЯПК (в частности, RanBP2) и ключевыми кофакторамиGle1 и DDX19 приводит к высвобождению мРНК в цитоплазму (8).Направление экспорта контролируется геликазой Dbp5, которая активируется вцитоплазме фактором Gle1, связанным с филаментами ядерной поры.
Ремоделирование РНПприводит к высвобождению экспортного комплекса NXF1-Nxt1 и его возвращению в ядро (поKöhler and Hurt, 2007).21Описанный выше механизм экспорта справедлив для большинства клеточных мРНК,однако некоторые транскрипты могут специфично экспортироваться NXF1. Например, NXF1может формировать комплекс AREX для экспорта мРНК, вовлечённых в митоз (Yamazaki et al.2010).
THOC5, компонент комплекса TREX, необходим для экспорта мРНК HSP70 (Katahira etal. 2009). Другой компонент TREX, ChTOP, опосредует экспорт других транскриптов (Chang etal. 2013). Сигналом готовности мРНК к экспорту также служат фосфобелки SR (Ser/Arg-rich),которые остаются связанными со сплайсированным транскриптом. SR-белки привлекаютсясплайсосомой в гипер-фосфорилированной форме, а после завершения сплайсинга становятсягипо-фосфорилированными и способны, в свою очередь, привлекать NXF1-Nxt1. Послеэкспорта в цитоплазму SR-белки фосфорилируются вновь, что дестабилизирует ихвзаимодействие с мРНК и NXF1-Nxt1 и также обеспечивает однонаправленность переноса РНПчерез ядерную мембрану (по Köhler and Hurt, 2007).
SR-белки могут опосредовать и сплайсингнезависимый экспорт, например, 9G8 и SRp20 узнают мотив ITE (intronless transport element) вмРНК гистона H2A (Huang et al. 2003).Иногдаопределяющеезначениедляэкспортаиграетспецифическаяпоследовательность в мРНК. Так, в конце раздела 1.1 была упомянута вируснаяпоследовательность CTE. Это первый описанный мотив, с которым белок NXF1 связываетсянапрямую (Bear et al. 1999). Аналогично функционирует последовательность SSCR (signalsequence coding region), которая присутствует в транскриптах, кодирующих секреторные белки(Kraut-Cohen and Gerst, 2010).
Похожий на CTE мотив RTE (RNA transport element) узнаётсябелком RBM15, который затем способствует привлечению NXF1 (Lindtner et al. 2006). мРНК,необходимые для репликации генома и репарации (например, RAD51, CHEK1, FANCD2),экспортируются под контролем IPMK (inositol polyphosphate multikinase). Для экспорта мРНКRAD51 определяющую роль играет специфическая последовательность в 3’UTR этой мРНК (поDelaleau and Borden, 2015).Второй основной механизм ядерного экспорта – CRM1-зависимый путь экспорта(chromosome region maintenance 1). Некоторые кофакторы здесь такие же, как при NXF1опосредованном экспорте, но NXF1, ALY/REF и CBP в него не вовлечены. CRM1 –кариоферин,которыйэкспортируетбелкислейцин-богатымNES,т.е.CRM1невзаимодействует с РНК напрямую. Основными мишенями для CRM1-экспорта являются мРНК,содержащие в 3’UTR сигналы двух типов: ARE (AU-rich elements) или 4ESE (4E-sensitivityelement).
С AREs взаимодействует белок HuR (human antigen R), а с 4ESE опосредованносвязывается фактор инициации трансляции eIF4E, 70% этого белка в клетке сосредоточено вядре. Недавно в эксперименте RIP-seq (RNA immunoprecipitation sequencing) было показано, что22в ядерной фракции с eIF4E ассоциировано примерно 2300 транскриптов (по Delaleau andBorden, 2015). CRM1-путём экспортируются из ядра также некоторые несплайсированные иличастично сплайсированные вирусные мРНК (по Köhler and Hurt, 2007).Самый нетривиальный путь, которым мРНК может покидать ядро, вообще не связанс ядерными порами. РНП частицы могут быть настолько большими, что не помещаются вцентральный канал поры.
Такие РНП отпочковываются от ядерной мембраны подобно тому,как это делает вирус герпеса. Отпочковывание (budding) характерно для большихрибонуклеопротеиновых гранул в нейромышечных контактах дрозофилы (Speese et al. 2012).Вбольшинствеслучаевэкспортируютсяизядратолькополностьюпроцессированные мРНК. Неправильно процессированные мРНК остаются в ядре иподвергаются деградации в экзосоме. Однако некоторые повреждённые мРНК всё же попадаютв цитоплазму. Трансляция белков с таких мРНК может быть опасна для клетки из-за ихтоксичности.
Самой мощной системой контроля качества мРНК является NMD (nonsensemediated mRNA decay). Этот механизм вступает в игру, когда в мРНК встречаетсяпреждевременный стоп-кодон. Чаще всего причиной этому является неправильный сплайсингсо сдвигом рамки считывания или сохранение интрона. Первый раунд трансляции являетсятестовым для всех мРНК, экспортируемых из ядра. Как только 5’-конец мРНК появляется изядерной поры, начинается трансляция. В норме стоп-кодон должен находиться в последнемэкзоне, т.е.
после него не встречаются EJCs. Когда после стоп-кодона остаются EJCs, такаямРНК подвергается деградации (по Alberts et al. 2008).1.2.3 Гены семейства Nxf D. melanogasterГены Nxf дрозофилы имеют ряд особенностей по сравнению с генами млекопитающих.Поскольку в работе речь идёт об основном гене семейства Nxf дрозофилы, рассмотримпредставителей семейства подробнее.В геноме D.melanogaster четыре гена Nxf (Nxf1-4). Хромосомная локализация генов Nxf –первое отличие дрозофилы от млекопитающих. У человека и мыши основные гены Nxf1 имеютаутосомную локализацию, а гены-паралоги формируют кластер на Х-хромосоме.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
