Диссертация (1145736), страница 13
Текст из файла (страница 13)
На 3’-конце мРНК изначальноотжигается олиго(dТ) праймер с линкером, комплементарный поли(А) хвосту мРНК, а присинтезе последовательности, комплементарной 5’-концу мРНК, обратная транскриптаза MMLV(Moloney Murine Leukemia Virus) нематрично синтезирует несколько нуклеотидов (обычно это3-4 нуклеотида dC) (Schmidt and Mueller, 1999). Далее в реакцию вводится олигонуклеотидследующей структуры – 5’-линкер-GGGG – и происходит переключение MMLV на этотолигонуклеотид в качестве матрицы. Это приводит к тому, что 5’- и 3’-конец фланкированыодинаковым линкером, и следовательно, для определения концевых последовательностейдостаточно поставить ПЦР с праймером, комплементарным линкеру, с одной стороны игеноспецифическим праймером с другой, а затем секвенировать полученные ампликоны.
Дляповышения специфичности амплификации используют 2 подхода: 1) step-out PCR (ПЦР свыходом наружу), блокирующая амплификацию с единичного праймера за счёт введенияинвертированных повторов в праймер (Matz et al. 1999), и 2) nested PCR (вложенная ПЦР),позволяющая получить чёткие гомогенные продукты амплификации путём использования вкаждом последующем раунде ПЦР праймеров, расположенных внутри ПЦР-продукта,полученного в предыдущем раунде.533.1Определение состава транскриптов в семенниках взрослыхособей линии дикого типа Oregon-RРанее в нашей группе было показано существование в семенниках D. melanogasterтранскриптов гена sbr длиной 1.9 т.н.
и 2.8 т.н. (Ivankova et al. 2010). Оба транскрипта корочеполноразмерноготранскрипта3.2 т.н.,однакопоследовательностиэтихтранскриптовопределены не были (Рис. 11). Здесь и далее под полноразмерным транскриптом имеется в видупоследовательность длиной 3280 н., размещенная в базе GenBank под номером NM_079921.3.В нашу задачу входила характеристика транскриптов методом RACE-PCR споследующим секвенированием ампликонов. Прежде всего, мы показали, что большинствосеменниковых транскриптов гена sbr укорочены с 3’-конца (Рис.
14) (Ginanova et al. 2016). Мыиспользовали в первом раунде ПЦР праймер в экзоне 4 и праймер в экзоне 9 во втором раунде.Полученный во втором раунде мажорный фрагмент свидетельствует о том, что всесеменниковые транскрипты заканчиваются практически в одной точке. По результатамсеквенирования длина 3’UTR транскриптов варьирует и составляет от 44 до 124 н.Полноразмерный 3’UTR, описанный в базах данных, насчитывает 757 н. Поэтому в семенникахдаже полноразмерные транскрипты (начинающиеся в экзоне 1) оказываются короче (2.8 т.н.),чем транскрипты в других органах (3.5 т.н.) (см. нозерн-блот на Рис.
11).Рисунок 14. Результаты 3′ RACE-PCR с образцами из различных органов, полученные сиспользованием одного и того же прямого праймера в экзоне 9 (ex9F) гена sbr. А – Схемарасположения праймеров в последовательных раундах RACE-PCR; Б – Электрофореграмма IIраунда ПЦР: основной продукт амплификации в семенниках (отмечен стрелкой) значительнокороче, чем в образцах из голов или яичников D.
melanogaster (Ginanova et al. 2016).54Что касается короткого семенниково-специфичного транскрипта 1.9 т.н., в результате5’ RACE-PCR было установлено, что он начинается в самом длинном интроне гена sbr(Ginanova et al. 2016). Интрон 3 является самым большим как в гене sbr D. melanogaster (62%длины гена), так и в генах-ортологах других дрозофилид. До 2001 года ген sbr даже былкартирован в геноме дрозофилы без учёта первых трёх экзонов. По нашим результатамтранскрипт 1.9 т.н.
представлен двумя основными типами (Рис. 15). Определяя 5'-конецтранскрипта 1.9 т.н., мы использовали в первом и втором раундах ПЦР праймеры в экзоне 7 ипраймер на границе экзонов 6 и 7 в третьем раунде (Рис. 15А). Результаты секвенированияпоказали, что транскрипты первого типа начинаются в интроне 3 с 9628 н. гена (вся нумерацияздесь и далее приведена по записи гена sbr в GenBank, ID 43944) и далее не отличаются отполностью сплайсированного транскрипта гена sbr.
Транскрипты второго типа тоженачинаются в интроне 3 чуть раньше (с 9580 – 9621 н., начало исследованных намитранскриптов варьирует), и обязательно подвергаются альтернативному сплайсингу. При этомвырезаются последние 237 нуклеотида интрона 3, представляющие собой интрон внутриинтрона, и 3'-сайт альтернативного сплайсинга совпадает с 3’-сайтом при обычном сплайсингеинтрона 3.Рисунок 15. Результаты 5’ RACE с образцами кДНК из органов самцов D. melanogaster дикоготипа с одним и тем же обратным праймером на границе экзонов 6-7 (ex6-7R) гена sbr. А –СхемарасположенияпраймероввпоследовательныхраундахRACE-PCR;Б–Электрофореграмма III раунда ПЦР: помимо полноразмерного транскрипта, такого же, как втканях головы, в семенниках существует также продукт амплификации (показан стрелкой)короче, что является отражением использования альтернативного промотора в тканяхсеменников. Видно также, что коротких фрагментов два – это два разных типа транскриптов,начинающихся в интроне 3 (подробности в тексте) (Ginanova et al.
2016).55Результаты 5’ RACE-PCR мы подтвердили, используя метод ОТ-ПЦР. Чтобы убедитьсяв существовании альтернативных промоторов в интроне 3, функционирующих в семенниках иприводящих к появлению двух разных типов транскриптов, мы подобрали несколько прямыхпраймеров к одному обратному (Рис. 16А). Обратный праймер был расположен в экзоне 5 иотделён дополнительным интроном для контроля того, что в ПЦР матрицей является кДНК, ане геномная ДНК. ПЦР-продукт, полученный с прямого праймера в экзоне 4 (праймер #3),присутствует в кДНК, полученной как из голов самцов, так и из семенников.
Использованиепрямых праймеров в интроне 3 (праймеры #2 и #1) и обратного в экзоне 5 позволяет получитьПЦР-продукты только с кДНК семенников. Это означает, что среди транскриптов в образцах,полученных из тканей головы D. melanogaster, отсутствуют такие, которые содержали быинтрон 3. Если взять прямой праймер (#1) перед участком в 237 н., образуется продукт, размеркоторого подтверждает удаление интрона длиной 237 н. В том случае, когда праймер (#2)располагается в районе последних 237 н., получение ПЦР-продукта доказывает существованиетранскриптов первого типа, в которых этот участок сохраняется (Рис. 16Б). Последовательностиампликонов, полученные с праймеров #1 и #2, были подтверждены секвенированием (Ginanovaet al. 2016).Рисунок 16.
Схема (А) и результаты (Б) ОТ-ПЦР с кДНК семенников и голов самцов-имагоD. melanogaster. Во всех трёх реакциях был использован один обратный праймер (R) и трипрямых: в интроне 3 (#1, #2) и в экзоне 4 (#3). В тех случаях, когда прямой праймеррасполагался в интроне, ПЦР-продукт можно было получить только с пробой из семенников.Длина ПЦР-продукта, полученного с использованием праймера #1, подтверждает вырезаниеинтрона длиной 237 н. из транскриптов второго типа (см. текст), которые начинаются в56интроне 3 и подвергаются альтернативному сплайсингу.
Более длинный ПЦР-продукт спраймером #2 – результат сохранения последовательности интрона 3 длиной 237 н. (Ginanova etal. 2016).Полученные нами результаты согласуются с результатами анализа данных CAGE-seqэксперимента (анализ проведён С.Ф. Кливером). CAGE-seq (Kodzius et al.
2006) – метод,позволяющий секвенировать участки кДНК, соответствующие 5’-концам кэпированной РНКэукариот, и таким образом, выявлять функциональные точки старта транскрипции – TSS – наполногеномном уровне. Для гена sbr в пробах из голов D. melanogaster мы обнаружили, что всетранскрипты начинаются на промоторах в первом экзоне гена, и не начинаются в интроне 3(Рис.
17). В семенниках транскрипция sbr начинает как в экзоне 1, так и в интроне 3. В интроне 3TSS картированы в пределах 9579 – 9668 н., основной пик приходится на 9613 н., что соответствуемвыявленным методом RACE-PCR транскриптам второго типа с вырезанным интроном 237 н.(Ginanova et al. 2016).Рисунок 17.
Точки начала транскрипции гена sbr в семенниках и головах самцовD. melanogaster, полученные в результате анализа данных CAGE-seq. Тотальная экспрессия sbrвыше в головах, чем в семенниках (её отражает высота пиков), как это наблюдается обычно иописановэкспрессионныхатласах.TSSсеменниково-специфичныхтранскриптовлокализованы как в экзоне 1, так и в интроне 3 гена sbr; в образцах из голов – только в экзоне 1.Значения TPM (tags per million reads) были вычислены для каждой из отмеченной на графике57позиций и характеризуют относительное количество транскриптов с разными TSS.
Нумерациянуклеотидов обозначена от начала гена sbr (Gene ID: 43944) (Ginanova et al. 2016).Важно отметить, что укорочение 3’-некодирующей области специфичных длясеменников транскриптов гена sbr не изменяет кодирующую область гена. Использованиеальтернативных промоторов в интроне 3 приводит к появлению белка, укороченного посравнению с полноразмерным. В этом случае первый кодон AUG располагается в началеэкзона 4, рамка считывания не сдвигается, поэтому обоим типам транскриптов, берущих началов интроне 3 (как с сохранением интрона 237 н., так и его удалением), соответствует один и тотже предполагаемый белок SBR, который укорочен с N-конца и состоит из 536 аминокислотвместо 672 (137 – 672 ак универсального белка).
Подробнее об экспериментальнойидентификации такого белка написано в разделе 3.9.3.2Определение состава транскриптов в образцах из головвзрослых особей дрозофилы линии дикого типа Oregon-RПри определении концевых участков экспрессируемых в тканях головы транскриптовгена sbr различий между самцами и самками мы не выявили, поэтому все описываемые далеетранскрипты характерны для взрослых особей D. melanogaster обоих полов. По результатам5’ RACE-PCR при использовании самых разных вариаций постановки реакций (праймеры впервом и втором раундах ПЦР – в экзоне 7, в третьем – в экзоне 5, в экзоне 4, экзоне 1, в5’UTR) нам удалось идентифицировать TSS в двух областях: в экзоне 1 и в экзоне 4 (Рис. 18А).Основной TSS транскриптов sbr в образцах из тканей головы расположен в экзоне 1(Рис. 18Б, # 1 и 2).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
