Диссертация (1145736), страница 12
Текст из файла (страница 12)
При постановке ПЦР-РВкаждая реакция была продублирована три раза. Для среднего Ct считали SEM – ошибкусреднего. Отношение СКО (среднеквадратичное отклонение) к средней Ct в экспериментахсоставляло не более 2,4%. Для вычисления относительного изменения экспрессии вычислялимаксимальную и минимальную разницы между средней Ct и SEM, возводили 2Е (где Е –эффективность реакции) в эти степени и вычисляли, таким образом, среднее значение ипогрешности для построения графиков.2.6Вестерн-блот анализ с антителами к фрагменту экзона 9белка SBRИз имаго D.
melanogaster в растворе PBS были выделены органы (яичники, семенники иголовы). Пробы для белкового фореза в 15% ПААГ (полиакриламидном геле) готовили сLaemmli sample buffer c DTT (Laemmli, 1970). Первичные поликлональные мышиные антитела,полученные ранее Наталией Иванковой, использовали в разведении 1:500. Вторичные антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (GE Healthcare UK Limited,Великобритания) – 1:4000. Детекцию осуществляли с использованием набора Western blottingdetection reagents (GE Healthcare UK Limited, Великобритания) и фотоплёнки Kodak (EastmanKodak Company, США) (Ginanova et al. 2016).492.7Дизайн пептидов, получение и очистка поликлональныхкроличьих антител на последовательности экзона 1 белка SBRСцельюполученияантителкбелкаN-концуSBRизпоследовательностинеструктурированного начального фрагмента белка (не принадлежит белковым доменам) быливыбраны 2 пептида длиной 15 аминокислот:№ пептида Аминокислоты в белке SBR (NP_524660.1) Последовательность пептида142 - 56DRNKRRVSFKPSQCL265 - 79RPEDLRRWDEDDDMSАнтигенность, гидрофильность и вторичные структуры были предсказаны с помощьюонлайн-сервиса Antibody Epitope Prediction, IEDB (Immune Epitope Database) Analysis Resource9.Также мы стремились к уникальности пептида для белков дрозофилы и кролика (анализпроведён С.
Ф. Кливером). Пептиды были синтезированы в лаборатории химии пептидовА. А. Колобова (ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России, СПб). Для усиления иммуногенности иудлиненияпериодакатионизированнымполужизниБСАсворганизмепомощьюпептидыбылибифункциональныхконъюгированыреагентовс(N-гидроксисукцинимидный эфир и глутаровый альдегид) сотрудником лаборатории биохимиибелка С. В. Родиным (ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России, СПб).Схема внутрикожной иммунизации кроликов была следующая (введение препаратаосуществлялось 10-15 инъекциями вдоль позвоночника):- иммунизация 1 – суспензия из 300 мкл раствора конъюгата пептида-БСА в PBS(эквивалентно 200 мг пептида) и 300 мкл полного адъюванта Фрейнда (Sigma, США);- иммунизации 2, 3, 4 – с интервалом в 2 недели; суспензия из 300 мкл раствораконъюгата пептида-БСА в PBS и 300 мкл неполного адъюванта Фрейнда (Sigma, США).На 12 день после 3ей иммунизации осуществляли забор крови из ушной вены, получениесыворотки (хранение с добавлением 0,02% w/w NaN3 в качестве консерванта при 4 °С).Проверка сывороток в ИФА (иммуноферментный анализ) показала аффинность каждойсыворотки к соответствующему конъюгату пептид-БСА.
Очистка сывороток на белке А длявыделения фракции IgG (колонка с сорбентом предоставлена А. В. Трофимовым, лабораториябиохимии белка ФГУП Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России, СПб) и последующий вестерн-блотанализ на тотальном растворимом белке дрозофил линии Oregon-R выявил различнуюспецифичность сывороток в отношении белков дрозофилы.Для получения препарата антител в большем количестве была проведена четвёртаяиммунизация кроликов, забор 40 мл крови и последующая очистка антител, которая включала всебя:9http://tools.immuneepitope.org/bcell50- концентрирование антител путём сульфатирования сывороток (итоговаяконцентрация сульфата аммония 45%) (Baines and Thorpe, 1992);- аффинная очистка на пептидах, сорбированных на CNBr-активированнуюSepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare, США), сорбенты приготовлены С. В.
Родиным;- повторное концентрирование антител путём сульфатирования.Аффинность полученных антител была подтверждена в ИФА и вестерн-блот анализе.Концентрация антител из сыворотки кролика, иммунизированного пептидом №2-БСАоказалось низкой, а сами антитела менее аффинными, поэтому дальнейший анализ проводилитолько с антителами, выработанными на пептид №1 (42 - 56 ак белка SBR –DRNKRRVSFKPSQCL).2.8Получение рекомбинантных белков SBR в E. coliДля подтверждения того, что полученные антитела способны связываться не только спептидами белка SBR (было показано в ИФА), но и с самим белком, были сделаны конструкциидля экспрессии белков SBR в бактериях:НазваниебелкаrecSBRНуклеотиды в мРНК генаsbr505-2523 (NM_079921.3)recSBR-ir505-1485 (NM_079921.3)+ 10572-10589(NC_004354.4)Обозначенные фрагменты былиСостав белкаCDS (coding sequence)Длинафрагмента2019 п.н.672 ак939 п.н.332 акCDS, принадлежащая экзонам 1-5, + 6первых кодонов интрона 5 (до первогостоп-кодона, включительно)амплифицированы с кДНК, полученной из образцовРНК яичников для RACE-PCR полимеразой Q5® High-Fidelity DNA Polymerase (NEB,Великобритания) и праймерами:в случае белка recSBR F: 5’-atcatatgcccaaacgcggc, R: 5’-atctcgagttacttcataaaagcctca(подчёркнуты сайты рестрикции).
Условия реакции: 1 цикл 30 секунд при 98°С, 35 циклов по 10секунд при 98 °С, 30 секунд при 55 °С и 1 минуте при 72 °С, 1 цикл 2 минуты при 72 °С, хранениепри 4 °С;в случае белка recSBR-ir F1: 5’- tgctgaaattcgcatatctt, R1: 5’-gggaacggcagggattgttc (условияпервой реакции: 1 цикл 30 секунд при 98 °С, 35 циклов по 10 секунд при 98 °С, 30 секунд при52 °С и 45 секунд при 72 °С, 1 цикл 1 минуту 30 секунд при 72 °С, хранение при 4 °С), F2: 5’aatctgtccatcttggaactcg, R2: 5’-atctcgagtcacaccatagtatacct (условия второй реакции: 1 цикл 30секунд при 98 °С, 35 циклов по 10 секунд при 98 °С, 30 секунд при 56 °С и 10 секунд при 72 °С, 1цикл 30 секунд при 72 °С, хранение при 4 °С), F3: 5’-atcatatgcccaaacgcggc, R: 5’atctcgagtcacaccatagtatacct (условия третьей реакции (overlap extension PCR): Pfu DNA polymerase(Thermo Scientific, США) 1 цикл 2 минуты при 95 °С, 10 циклов по 15 секунд при 95 °С, 20секунд при 40 °С и 2 минуты при 72 °С, 1 цикл 4 минуты при 72 °С, далее – добавление51праймеров и следующий цикл: 1 цикл 3 минуты при 95 °С, 35 циклов по 30 секунд при 95 °С, 30секунд при 50 °С и 2 минуты при 72 °С, 1 цикл 4 минуты при 72 °С, хранение при 4 °С).Фрагменты были клонированы в вектор pJet2.1, секвенированы, затем переклонированыв вектор pET-22b(+) (Novagen, США) по рестрикционным сайтам NdeI и XhoI.
Для экспрессии вE. coli использовали экспрессионный штамм BL21 Star™ (DE3) (Invitrogen, США). Условияэкспрессии: среда LB+Amp100+Glucose 0.4%; ночная культура – засев отдельной колонии счашки в 5 мл среды, 37 °С; дневная культура – 0,1 OD ночной культуры в 10 мл среды, 37 °С,растить до OD=2-3, отобрать 2 OD на анализ; индуцировать экспрессию с промотора Т7добавлением в среду 0,5 mM IPTG; растить при 30 °С 3 часа, отобрать 2 OD на анализ.Эффективность индукции проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле (ПААГ)культур до и после индукции.
В обоих случаях после индукции детектировался белок нужноймолекулярной массы.2.9Вестерн-блот анализ с антителами к фрагменту белка SBR,соответствующему части экзона 1Из имаго D. melanogaster дикого типа в возрасте 3-5 суток были выделены органы(яичники, семенники и головы) в растворе PBS + 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride –ингибитор протеаз) (Диаэм, Россия). После окончания препарирования PBS отобрали и залилиорганы 50 мкл буфера для экстракции (Emery, 2007) + 1 mM PMSF, гомогенизировалипестиком.
Для получения растворимой фракции белков центрифугировали трижды при16.000 g, 4 °С, каждый раз перенося супернатант в новый эппендорф, чтобы избавиться отлипидной фракции. Концентрация белка в пробах была определена Pierce™ BCA Protein AssayKit (Thermo Scientific, США), в анализ брали одинаковое количество тотального белкадрозофилы из разных органов – по 5 мкг на лунку шириной 0,5 см, равномерность нанесенияконтролировали путём окрашивания нитроцеллюлозной мембраны после переноса растворомPonceau S. Пробы для денатурирующего электрофореза в 12% ПААГ готовили с Laemmlisample buffer с β-меркаптоэтанолом (Laemmli, 1970).
Первичные поликлональные кроличьиантитела, полученные нами, использовали в концентрации 5 мкг/мл. Вторичные анти-кроличьиантитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) – 1:3000. Детекциюосуществляли с использованием DAB Substrate Tablets (Amresco, США). Используемый маркермолекулярного веса ColorPlus™ Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kDa) (NEB,Великобритания).52Глава 3 РезультатыПлейотропные эффекты мутантных аллелей гена sbr заставляют задуматься ополифункциональностиэтогогена.Понашейгипотезе,различныефункциимогутреализовываться специализированными продуктами, кодируемыми геном sbr, поэтомунеобходимо было охарактеризовать максимально возможный спектр его транскриптов ибелков. В 2010 году в нашей исследовательской группе была опубликована статья, в которойметодом нозерн-блот гибридизации с использованием кДНК-зонда, соответствующегоаминокислотам 137 – 672 белка SBR, и геномного фагового клона было показано наличиенескольких транскриптов гена sbr, различающихся по размеру и органоспецифичности(Ivankova et al.
2010).В данной работе мы применили различные методы ПЦР, чтобы определить точныйсостав транскриптов, характерных для различных органов D. melanogaster и оценитьколичественное соотношение различных транскриптов, а также проверить, кодируют ли белки,отличные от полноразмерного, некоторые из описанных нами транскриптов.Основной метод, позволяющий определить 3’- и 5’-концы транскриптов – это RACEPCR (rapide amplification of cDNA ends – быстрая амплификация концевых последовательностейкДНК). Суть метода заключается в том, что на этапе получения кДНК оба конца транскриптаопределённым образом метятся, что при дальнейшем секвенировании продуктов ПЦР даётоднозначную информацию о концевых последовательностях.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
