Диссертация (1145736), страница 15
Текст из файла (страница 15)
21). Прииспользовании праймеров, распложенных после второй последовательности поли(А) интрона,становится возможным детектировать транскрипты, доходящие до конца референсноготранскрипта гена sbr. В пользу этого свидетельствует выявляемый в образцах тканей головывзрослых особей интрон-содержащий транскрипт 5.1 т.н. (Ivankova et al. 2010).63Рисунок 21.
Результаты 3’RACE-PCR для определения концов транскриптов гена sbr ссохранённым интроном 5 в образцах тканей головы взрослых особей дрозофилы. А – Схемарасположения праймеров в последовательных раундах 3’ RACE-PCR; Б – ЭлектрофореграммаII раунда 3’ RACE-PCR: продукты, получаемые с праймеров до первой последовательностиполи(А) в интроне 5 (ex5F (здесь не показано) и in5F-114) заканчиваются на первойпоследовательности поли(А), с праймера между первой и второй последовательностямиполи(А) (in5F-763) – на второй последовательности поли(А). В результате реакций спраймерами in5F-1282 (здесь не показано) и ex7F образуется продукт, доходящий до самогоконца гена (1635 н.).Полученные результаты заставляютзадуматься, действительно лисуществуюттранскрипты, заканчивающиеся на последовательностях поли(А) в интроне 5, или это связано сметодическими проблемами при проведении RACE-PCR.
Ведь изначально, в реакции обратнойтранскрипции для получения полноразмерных кДНК, используется олиго(dТ) праймер,который способен отжигаться на любую последовательность поли(А), в том числе в интроне 5,приводя к формированию ложных концов транскриптов. Также, по-видимому, полимераза,используемая в RACE-PCR, не в состоянии пройти через сложные вторичные структуры,образуемые интроном 5. По нашему опыту, получение амплификата интрона 5 – достаточнонепростая задача: из широкого спектра применяемых нами полимераз (Q5® High-Fidelity DNA64Polymerase (NEB, Великобритания), iProof™ High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad, США), PfuDNA polymerase, Long PCR Enzyme Mix, High Fidelity PCR Enzyme Mix (Thermo Scientific,США), Encyclo, Tersus (Евроген, Россия)), ни с одной не удалось получить продуктполноразмерного интрона 5.
Вопрос об окончании транскриптов в интроне остаётся открытым.Если предположить, что часть транскриптов заканчивается в интроне 5, то количествотранскриптов, содержащих последовательность экзона 4 должно быть больше, чем количествотранскриптов, содержащих экзон 9. Эти участки гена попадают во все возможные транскриптыгена sbr (далее, Рис. 26). Чтобы количественно определить содержание транскриптов свключением различных участков гена sbr, мы использовали метод ПЦР в реальном времени.3.5Количественная характеристика некоторых типовтранскриптовНаш подход к ПЦР-РВ не совсем обычен. Мы сравниваем не экспериментальные группыособей между собой или с контролем, определяя экспрессию тех или иных генов, а разныеучастки гена sbr между собой, относительно внешнего референсного гена. Для различенияальтернативных транскриптов sbr мы подобрали праймеры к участкам, которые присутствуютво всех транскриптах – в экзонах 4-5, а также к специфическим участкам, которые могут и непопадать в транскрипт: в экзоне 9, в интроне 5, на границе экзона 5 и интрона 5.
Впланировании и проведении ПЦР-РВ мы пользовались руководством MIQE: MinimumInformation for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments (Bustin et al. 2009),позволяющимвыполнитьаккуратныйдизайнэксперимента.Так,былаисключенаконтаминация образцов кДНК геномной ДНК (что важно при определении интрон-содержащихтранскриптов), определены эффективностиреакцийдля каждойиз пар праймеров,использованы несколько референсных генов для внутреннего контроля и несколькоинструментальных и биологических повторений экспериментов.Прежде всего, мы проверяли гипотезу о том, что некоторые транскрипты окончиваютсяв интроне 5.
Для этого мы сравнивали результаты амплификации с праймеров ex4-5 (на границеэкзонов 4 и 5) и ex9 (в экзоне 9) в образцах, полученных из различных органов взрослых особейD. melanogaster дикого типа. В этом эксперименте были использованы праймеры с доказаннойодинаковой эффективностью ПЦР. Это позволяет сравнивать образцы разных тканей, а такжеразные участки гена между собой в любых комбинациях.Полученные в этом эксперименте результаты весьма интересны. Если о неодинаковомуровне экспрессии гена sbr в тканях головы, семенников и яичников говорит и FlyAtlas 201310,10http://flyatlas.gla.ac.uk652016) – база данных по экспрессии генов дрозофилы – то информацию о неравномерностиэкспрессии разных участков гена объяснить гораздо сложнее.
На первый взгляд данные о том,что интенсивность транскрипции участка ex4-5 всегда больше (рис. 22), согласуется спредположением, что некоторые транскрипты заканчиваются в интроне 5 и поэтому несодержат участка ex9. Однако аналогичную картину мы видим и в тканях семенников, длякоторых интрон-содержащие транскрипты в экспериментах RACE-PCR мы всегда выявляли вследовых количествах.Рисунок 22.
Соотношение присутствия двух участков в транскриптах sbr в разных органахдрозофил дикого типа линии Oregon-R. ex4-5 – пара праймеров, где прямой расположен вэкзоне 4, а обратный в экзоне 5; ex9 – пара праймеров в экзоне 9. В образцах, приготовленныхиз голов и яичников экспрессия гена больше, чем в образцах из семенников. Участок ex4-5более представлен в транскриптах из всех проанализированных органов, чем ex9.Практически полное отсутствие транскриптов с интроном 5 в тканях семенников мынезависимо подтвердили с использованием ПЦР-РВ. В этом случае в дополнение к ужеописанным участкам были добавлены ещё два: в середине интрона 5, между первой и второйпоследовательностями поли(А) (in5mid) и участок, захватывающий конец экзона 5 и началоинтрона 5 (ex5-in5) (рис. 23).66Рисунок 23.
Соотношение присутствия разных участков в транскриптах sbr в образцах кДНК,полученных из семенников и голов самцов дрозофил линии Oregon-R. ex4-5 – пара праймеров,где прямой расположен в экзоне 4, а обратный в экзоне 5; ex5-in5 – прямой праймер в концеэкзона 5 и обратный в начале интрона 5; in5mid - в середине интрона 5. В семенниках участки синтроном 5 практически не встречаются среди транскриптов гена, в отличие от образцов,полученных из голов тех же самцов дрозофил.Исследование показало, что в семенниках практически не встречаются участки синтроном 5, а в образцах, полученных из голов тех же самцов, наоборот, среди транскриптовгена sbr довольно много фрагментов интрона.
С учётом эффективности реакций с разнымипарами праймеров мы рассчитали разницу в интенсивности экспрессии различных участков дляобразцов из семенников и голов по методу Michael W. Pfaffl (Pfaffl, 2001). Принимаяинтенсивность экспрессии в образце из семенников за единицу, мы получаем увеличениеинтенсивность экспрессии в образце из голов в 2 раза для ex4-5; в 19 раз для ex5-in5; в 28 раздля in5mid. Использование в анализе двух участков интрона 5 дало одинаковый результат(различия лежат в пределах погрешности).Наличие или отсутствие интрона 5 среди общего пула транскриптов никак не объясняетнаблюдаемую разницу между интенсивностью транскрипции участков четвёртого и девятогоэкзонов.
Этот результат пока не получил объяснения.Поскольку мы не смогли полностью исключить возможность окончания транскриптовгена sbr в интроне 5, мы решили оценить такую возможность для гена Mm nxf1 мыши. В67интрон-содержащем транскрипте гена Mm nxf1 сохраняется интрон 10 (Sasaki et al.
2005), и внём отсутствуют последовательности поли(А), по-видимому, препятствующие прохождениюПЦР.3.6Существуют ли транскрипты, оканчивающиеся в интроне 10,в различных тканях M. musculus?Транскрипты, в которых сохраняется интрон, гомологичный интрону 5 гена sbrD. melanogaster, существует у представителей самых разных таксонов с известной интронэкзонной организацией генов: от нематод до позвоночных, включая человека. В отличие отпредставителей семейства Drosophilidae в интроне 10 гена Nfx1 позвоночных нет протяжённыхпоследовательностей поли(А) (Мамон и др.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
