Диссертация (1145736), страница 14
Текст из файла (страница 14)
По результатам 5’ RACE-PCR с последующим секвенированием мыидентифицировали два типа ПЦР-фрагментов: #1 – это транскрипты, начинающиеся в самомначале гена – c 2, 13 и 22 н.; #2 – менее многочисленные транскрипты, начинающиеся в районе206-236 н. Транскрипты #2 не были описаны ранее. По данным CAGE-seq, приведённым впредыдущем разделе (3.1), TSS расположены именно в этих областях (Рис. 17). Оба типатранскриптов могут кодировать полноразмерный белок Dm NXF1, поскольку старт-кодоннаходится позже – в позиции 505 н.Фрагмент #3 представляет собой минорную фракцию транскриптов, которые начинаютсяс 282 н.
экзона 4 (Рис. 18Б, #3). Похожая мРНК описана в рамках проекта Berkeley DrosophilaGenome Project в 2000 году и представлена в базе данных под номером AY069415, ноначинается она с 488 н. экзона 4. Из-за нестабильности мРНК возможны вариации в точномопределении её концевых последовательностей, что мы, по-видимому, и наблюдаем вэкспериментах. Белковый продукт таких транскриптов, если он существует, отличается от58полноразмерного белка Dm NXF1: первые 2 ORF кодируют короткие пептиды длиной 17 и 1 ак.(MetOp*), а трансляция с третьего старт-кодона приведёт к образованию белка Dm NXF1размером 431 ак (242 – 672 ак).
Для проверки существования такой белковой формынеобходимы дополнительные эксперименты.Рисунок 18. Результаты RACE-PCR при определении 5’-концов и 3’-концов транскриптов генаsbr в тканях головы самцов и самок D. melanogaster. А – Схема расположения праймеров впоследовательных раундах 5’ RACE-PCR; Б – Электрофореграмма III раунда 5’ RACE-PCR сиспользованием праймера в экзоне 5: обнаружены TSS в начале 5’UTR – #1, что соответствуетполноразмерному транскрипту; на расстоянии 200 н. от начала 5’UTR – #2; в середине экзона 4– #3; Г – Схема расположения праймеров в последовательных раундах 3’ RACE-PCR; В –Электрофореграмма III раунда 3’ RACE-PCR с использованием праймера в 3’UTR: транскрипт#1 соответствуют полноразмерному транскрипту sbr; транскрипт #3 заканчиваются за 286 н. доконца 3’UTR; минорный транскрипт #2 секвенировать не удалось.В ходе анализа 3’-концов мРНК гена sbr были впервые выявлены альтернативные сайтыполиаденилирования в образцах из голов D.
melanogaster. Альтернативная терминациятранскрипции происходит в результате расщепления транскрипта на некотором расстоянии от59сайта полиаденилирования, причём именно узнавание сайта полиаденилирования являетсясигналом к терминации транскрипции (подробнее об этом в разделе 4.1). Мажорныетранскрипты #1 являются полноразмерными, минорные транскрипты #2 нам не удалосьсеквенировать.
Для #3 было показано, что транскрипты заканчиваются в районе 471 н. 3’UTR,т.е. за 286 н. до конца 3’UTR (Рис. 18В).3.3Определение состава транскриптов в яичниках взрослыхособей линии дикого типа Oregon-RСреди проанализированных тканей самое большое разнообразие транскриптов sbr намудалось выявить в яичниках взрослых самок (3 – 5 суток).
Яичники зрелых самок представляютсобой яйцевые камеры на разных стадиях развития (циста из 16 клеток, окружённаясоматическими фолликулярными клетками).Для определения 5’-концов транскриптов были использованы те же праймеры, что и вслучае с образцами, полученными из голов дрозофил. В ходе анализа было выяснено, чтомажорная фракция транскриптов начинается не в 5’UTR, как это ранее было показано дляостальных органов, а значительно позже – в середине экзона 2 (с 73 н.
экзона 2), в серединеэкзона 3 (с 51 н. экзона 3), в начале экзона 4 (с 22 и 40 н. экзона 4). Транскрипты, стартующие в5’UTR тоже существуют, но их гораздо меньше, и превалирующими среди них является те, чтоначинается спустя 200 н. от начала 5’UTR (с 206, 221, 236 н.), хотя есть и транскрипты, которыедоходят до самого начала гена (Рис. 19Б).60Рисунок 19. Результаты RACE-PCR для определения 5’ и 3’-концов транскриптов гена sbr втканях голов и яичников D. melanogaster. А – Схема расположения праймеров впоследовательных раундах 5’ RACE-PCR; Б – Электрофореграмма III раунда 5’ RACE-PCR сиспользованием праймера в экзоне 5: обнаружены TSS в начале экзона 4 – #1; в серединеэкзона 3 – #2; в середине экзона 2 – #3; спустя 200 н.
от начала 5’UTR – #4; в начале 5’UTR – #5(соответствует полноразмерному транскрипту); Г – Схема расположения праймеров впоследовательных раундах 3’ RACE-PCR; В – Электрофореграмма III раунда 3’ RACE-PCR сиспользованием праймерав 3’UTR:транскрипт#1соответствуютполноразмерномутранскрипту sbr; мажорный в тканях яичников транскрипт #3 заканчиваются за 286 н. до конца3’UTR; минорный транскрипт #2 секвенировать не удалось.Новых 3’-концевых последовательностей в тканях яичников по сравнению странскриптами, выделенными из голов тех же особей, выявить не удалось. Мажорным вяичниках является не полноразмерный, а укороченный на 286 н.
вариант (Рис. 19В).613.4Транскрипты гена sbr с интроном 5 в различных органахвзрослых самцов и самок линии Oregon-RПоскольку ранее было показано, что нейроспецифичный транскрипт 5.1 т.н. образуетсяпутём сохранения интрона 5 длиной 1602 н. (Ivankova et al. 2010), мы отдельно анализировалимРНК, которые содержат указанный интрон.При постановке 5’ RACE-PCR были использованы праймеры в интроне 5 в первых двухраундах, что позволило исключить из анализа транскрипты, не содержащие интрон 5, ипраймер в экзоне 4 в III раунде (Рис.
20). Продукты амплификации были видны уже во второмраунде, а третий раунд лишь увеличил их количество, потому мы уверены, что анализируемименно транскрипты, содержащие интрон. Таким образом, было показано, что интронсодержащие транскрипты начинаются там же, где и полностью сплайсированные – с 23 н. и231 н. от начала гена sbr.ex4ex5in5TTACAAAACGCCCAGATATACGAAAAGGAAACACTCTTGAGTGCTCTATTGGCAGCGATGTCGCCACATGTCTTTATTCCTCAATATTGGCGAGTGGAGCGAAACTGCGTAATCTTCTTTACGGACGACTACGAGGCAGCCGAACGCATTCAACATCTGGGCAAGAATGGCCATCTTCCAGATGGCTATCGTCTGATGCCACGAGTACGCAGCGGTATACCACTAGTGGCCATCGACGATGCCTTCAAGGAGAAGATGAAGGTCACAATGGCCAAGCGTTACAATATTCAAACCAAGGCGCTGGATCTTTCCCGTTTTCATGCAGATCCGGATCTTAAGCAAGTTTTCTGCCCACTCTTTCGTCAGAATGTGATGGGCGCTGCCATTGACATTATGTGCGACAATATACCCGATTTGGAGGCACTTAACCTGAATGACAACTCCATTAGCAGCATGGAGGCGTTTAAGGGTGTGGAGAAACGCTTACCGAACCTCAAGATTCTCTATTTGGGGGATAACAAGATACCATCTTTGGCCCACCTTGTAGTGCTTCGCAATCTGTCCATCTTGGAACTCGTTTTAAAGAACAATCCCTGCCGTTCCCGCTACAAGGATTCCCAGCAGTTTATCAGgtatactatggtgtgattcgttgatcttctaacttttctagtggatgctgccgcatattcgacgtgggatttgtcgcgtctggagttacagaggaattaggattaccacatttccattgttctgttgtctccattccttttctttgaagcaaatgcgctgcagaattggggaccaaggtcaggtgttgccttcgtccaaagtttaaagcagctgagcaggcaaaggcatttgggaaatattttccttatcagctgtcttaaagccaggacagatcgtatgcagcggaatggattttgggcagagcaaaaaaaaaaaaaagaagaaagaaaaaaaaagatttgaagttaaaaaaaaaaaagaaaaaaaaagaagaaaaaaaaagaaaaaaaagtacaagcaaaaaaggcccaagccaattgcagtaaactttcgacgatgtggcaacgctaaactaagaacgcaactgtacttttgacacacacacaccggcaccgttcgtacttccaattgagcaggcggacgtgcagcagtcccaaagcgaatcacattaacgcattaacatcgacaaatataaattattttacgaataacaaataatccaccgaacccacccaccgcgcaccccgctacaacacacacacgggcgcacgcatgtagccactccacgccagcgcacgcacgcatgcgcatgcgcatatgcagttgtgtacgtgccacatctaatgctgcgtgccctgtgcgcgccgttgcgccttgcattgtcgtgtcgccgcttgttg5’ раунд III3’ ex5F5’ раунд II3’ in5F-1145’ раунд I3’ in5F-76362attttgcggtggttgccaagtagtggaggcagagtggagtgcataggctcaccattcgggtgcgcagcgtccagcaggaagcagaaacgactaccaagacgaaggacacaccactgactgactcacgtgctaacggacattctgctggcgccagcggccggcgcgttgttttgccagtcgattacaatttacaattagtattttcggctttgttgggcgcatgagccgcctgcggatgcgacgtgcttgaacatgacgagacgaacagaagttacacagcagtcagctttgaaagccactttttgcttgtggccactgaaagaaaaaacaaaaaaaaaaaaatgaaaaaaaggaaaagaaaaaagtgttgataaaaaaaaaaaaacaaaaaatacaaaagagaaaataccacaaaaaagatgccccggcacaatgcactgctcaattgtacttttccgctgtacttttcacatcgaactattgaaggcacaacaatggccaagcacctagtgcctctgcctcttcagctgatcaaagctccgccaatttgtgtgtgagccggtcgagtaacggtgaagctatatcaaagatacaaacatatatactccgcgtgagaagaagaaggagtcacatctggccactgactaatctgcaattcctgcagcgcatacatcctaaacctccccccccccccaccaacgcacaaatttaaaaaaaaaacccccatttaattattatttctcgctatttaactcgcatatctatcatcgcctccctgtgctaatgacaacaaaaatacggccgaatgtccactatttacag3’ in5F-1282Рисунок 20.
Схема (А) и результаты (Б) 5’RACE-PCR для определения концов транскриптовгена sbr с сохранённым интроном 5. При увеличении числа циклов ПЦР ампликоны появляютсяи в первых двух образцах тканей самцов.Ниже приведено расположение праймеров для RACE-PCR, связанных с интроном 5. Праймерыдля 5’ RACE-PCR (см. схему А) выделены зелёным. Праймеры I и II раундов расположены вначале интрона 5 перед последовательностями поли(А) (выделены красным шрифтом),мешающими прохождению ПЦР. Праймер III раунда – в начале экзона 4 для nested PCR суменьшением длины и увеличением количества образующихся ампликонов по сравнению сраундом II.Праймеры для 3’ RACE-PCR выделены жёлтым и подчёркнуты.
Праймеры ex5F и in5F-114расположены до первой последовательности поли(А), праймер in5F-763 – между первой ивторой последовательностями поли(А), праймер in5F-1282 – после второй последовательностиполи(А).Для выяснения точек окончания транскриптов с сохранённым интроном 5 былапроведена серия 3’ RACE-PCR с праймером I раунда с экзоне 4 и несколькими праймерами IIраунда: в экзоне 5, интроне 5 до первой последовательности поли(А) – in5F-114 и между первойи второй поли(А) последовательностями – in5F-763, после второй последовательности поли(А)– in5F-1282 и в экзоне 7 (Рис. 20). Оказалось, что при использовании праймеров до первойпоследовательности поли(А) в интроне 5 в ПЦР образуются фрагменты, заканчивающиеся напервой последовательности поли(А), а при использовании праймера между первой и второйпоследовательностями поли(А) – на второй последовательности поли(А) (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
